Количественная оценка распределения пресинаптического белка в мозге мыши с помощью иммунофлюоресценции

Возьмем химически фиксированный срез мозга мыши, помещенный в среду, обеспечивающую встраивание тканей.

Промойте ломтик буфером, чтобы удалить среду.

Добавьте раствор, который пронизывает мембраны и блокирует неспецифические участки связывания.

Удалите раствор.

Чтобы визуализировать нейрональные синаптические белки, инкубируйте срез с первичными антителами.

Эти антитела нацелены на пресинаптический белок, экспрессируемый в синапсах определенных областей мозга, и повсеместно экспрессируемый синаптический белок в качестве референсного маркера.

Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела.

Введение меченных флуорофорами вторичных антител, нацеленных на первичные антитела.

Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.

Покрасьте ядра ДНК-связывающим красителем.

Промойте с помощью буфера и закрепите ломтик с помощью подходящего монтажного материала.

Визуализируйте срез под конфокальным микроскопом.

Рассчитайте средние отношения интенсивности флуоресценции целевого белка и референсного маркера, чтобы проанализировать распределение целевого белка по различным областям мозга.

Чтобы подготовить срезы к иммуноокрашиванию, с помощью пластиковой пипетки удалите раствор ПБ из одной лунки без втягивания срезов мозга. Затем с помощью пипетки объемом 1000 микролитров добавьте 250 микролитров свежего PB, чтобы промыть их от избытка OCT. Повторите эту промывку для каждой лунки в то время, чтобы избежать пересыхания ломтиков.

Затем с помощью пластиковой пипетки удалите раствор PB из первой лунки. Используйте пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы добавить 250 микролитров блокирующего буфера в лунку, чтобы снова и снова работать хорошо. Выдержите тарелку при комнатной температуре в шейкере в течение трех часов. Во время инкубации по 250 мкл антитела буферизуют на лунку в реакционную пробирку.

Затем с помощью пипетки объемом 2 микролитра добавьте соответствующее количество антител, пипетируйте его непосредственно в раствор и осторожно пипетируйте вверх и вниз несколько раз, чтобы перемешать. Затем сделайте вихревой прием этого разведенного антитела, чтобы обеспечить правильное перемешивание.

Прорабатывая последовательно, удалите блокирующий буфер пластиковой пипеткой и добавьте 250 микролитров раствора первичного антитела на лунку. Выдержите тарелку в шейкере при температуре 4 градуса Цельсия на ночь.

На следующий день удалите раствор антитела с помощью пластиковой пипетки. Вымойте ломтики с помощью 300 микролитров промывочного буфера 1 на лунку, три раза по 10 минут каждый промойте в шейкере при комнатной температуре. Во время промывки, работая в темноте, разбавьте вторичное антитело, связанное с флуорофором, в реакционной пробирке таким же образом, как это было сделано ранее с первичным антителом.

После завершения промывки снимите промывочный буфер с помощью пластиковой пипетки и добавьте 250 микролитров раствора вторичного антитела на лунку. Выдерживать в темноте при комнатной температуре в течение 90 минут. После завершения инкубации удалите раствор антител с помощью пластиковой пипетки. Промойте секции три раза с помощью промывочного буфера 2 так же, как и с помощью промывочного буфера 1.

Во время этой стирки разбавьте краситель DAPI в 0,1 молярного PB до концентрации 1 к 2000. Сняв с тарелки промывочный буфер, добавьте 250 микролитров раствора DAPI, и выдерживайте при комнатной температуре на шейкере в течение 5 минут.

После удаления раствора DAPI с помощью пластиковой пипетки с помощью пипетки объемом 1000 микролитров добавьте 500 микролитров 0,1 молярного PB на лунку. Поместите предметное стекло микроскопа под стереоскоп. С помощью тонкой кисти добавьте три отдельные капли 0,1 молярного PB на предметное стекло. С помощью кисточки поместите по одному ломтику на каждую каплю на предметное стекло, а затем разровняйте и сориентируйте срезы.

После того, как все срезы расположены правильно, удалите излишки ПБ бумажной салфеткой и тщательно высушите, не высушивая срезы полностью. Затем добавьте 80 микролитров закладной среды на предметное стекло и осторожно накройте его покровным стеклом, чтобы вставить срезы мозга.

Накройте предметные стекла, чтобы избежать воздействия света, и дайте им высохнуть в вытяжном шкафу на один-два часа, а затем храните их в предметной коробке микроскопа при температуре 4 градуса Цельсия до готовности к конфокальной микроскопии.

После получения виртуальных тканей всего среза мозга для различных каналов, как описано в рукописи, загрузите все отдельные каналы для одного изображения на Фиджи, нажав «Файл», а затем «Открыть». Затем используйте инструмент выделения от руки, чтобы очертить одно полушарие в канале DAPI. Нажмите «Редактировать», затем «Выделение», а затем «Создать маску», чтобы создать маску выбранной области.

Затем нажмите «Анализировать», а затем «Измерить частицы», чтобы определить среднюю интенсивность флуоресценции для отдельных каналов, выбрав разные каналы для определения средних значений интенсивности флуоресценции для каждого канала.

После этого скопируйте среднюю интенсивность флуоресценции для отдельных каналов в таблицу. Чтобы определить среднюю интенсивность флуоресценции для отдельных каналов в области интереса, очертите область с помощью инструмента произвольного выделения.