Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых Drosophila Мозги

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы описать простую одноэтапную процедуру вскрытия мозга взрослой дрозофилы, которая может быстро получить мозг с хорошо сохранившейся морфологией, пригодной для анализа всего мозга. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области нейробиологии и генетики. Это включает в себя точное картирование схем мозга, изучение эффектов генетических манипуляций с нейронами и функциональную характеристику генов.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она предполагает простую в освоении процедуру. Он может облегчить препарирование мозга взрослой мухи с хорошо сохранившейся морфологией менее чем за 10 секунд. Видеодемонстрация этого метода имеет решающее значение, так как контроль необходимого импульса при отпускании щипцов для отрыва экзоскелета, окружающего голову мухи, требует навыков и практики.

Эти крошечные, надоедливые плодовые мушки научили нас многому о биологических принципах. Они также могут помочь нам найти причины и лекарства от болезней человека, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. С помощью препарирующего микроскопа, установленного на увеличение в 1,2 раза, обездвижите обезболенную муху и погрузите ее в холодный раствор для вскрытия животом вверх.

Держите щипцы под углом от 160 до 170 градусов относительно пластины для вскрытия, а затем приложите небольшое усилие к брюшной полости мухи. Это должно обездвижить муху, заставить голову откинуть назад на 15-25 градусов и вытянуть хоботок вверх. После этого маневра должна стать заметной мягкая полупрозрачная область кутикулы под хоботком.

Увеличьте увеличение и отрегулируйте фокальную плоскость на этой области. Используя доминирующую руку, возьмите пару рассекающих щипцов и надавите, чтобы закрыть кончики. Расположите щипцы перпендикулярно щипцам, удерживающим ширинку.

Прокалывайте сомкнутые кончики щипцов через мягкую полупрозрачную область кутикулы, стараясь не проникнуть настолько глубоко, чтобы они задели мозг. Затем быстро, но неуклонно отпустите щипцы, чтобы точки раскрылись, отрывая экзоскелет головы мухи. Используйте импульс от отпускания кончиков щипцов, чтобы аккуратно удалить экзоскелет и большую часть головного каркаса, глаза и трахеи из ткани мозга одним движением.

Теперь должен быть виден неповрежденный мозг. С помощью щипцов осторожно удалите оставшиеся вспомогательные ткани, такие как белая фиброзная ткань трахеи, стараясь не вытянуть и не повредить сам мозг. Поместите расчлененные образцы мозга с соответствующими торсами примерно в один миллилитр 4% параформальдегида на лед на 40-60 минут.

Удалите параформальдегид, а затем промойте образцы одним миллилитром одного X PBS, пипетируя раствор вверх и вниз три раза, стараясь не допустить аспирации мозга. Далее удалите PBS и затем промойте пять раз одним миллилитром одного X PBT в течение пяти минут каждый с нутацией. Добавьте первичное антитело, представляющее интерес, в соответствующем разведении.

А затем инкубировать образцы в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с нутацией. Удалите первичное антитело и промойте образцы пять раз одним миллилитром одного X PBT в течение пяти-10 минут при каждом промывании с нутацией. Добавляйте вторичные антитела к промытым образцам в соответствующем разведении и во время инкубации.

После этого промывайте образцы шесть раз в одном миллилитре одного X PBT в течение 10 минут каждый с нутацией. Этот шаг имеет решающее значение для удаления любых неспецифически связанных вторичных антител. Инкубируйте образцы в разведении от одного до 10 000 одного миллиграмма на миллилитр DAPI в одном миллилитре одного раствора X PBT в течение 30-60 минут с нутацией.

Наконец, промойте образцы, добавив один миллилитр одного X PBS, а затем трижды дозируйте раствор вверх и вниз. Наденьте защитное стекло на монтажную направляющую. С помощью пипетки с отрезанным наконечником перенесите мозги в одном растворе X PBS на покровную крышку.

Далее с помощью щипцов отделите мозги от тел. Используйте тонкий наконечник для пипетки, чтобы удалить жидкость вокруг мозговой ткани. А затем добавьте от 20 до 40 микролитров монтажной среды, предотвращающей выцветание.

Аккуратно распределите мозги, при этом вытесняя вязкую среду наружу. Начиная с одной стороны, осторожно опустите на образцы вторую защитную трубку, стараясь свести к минимуму контакт мозга с пузырьками. Дайте слипам осесть, а затем удалите лишнюю жидкость с края слипов с помощью лабораторной салфетки.

С помощью небольшого кусочка скотча временно прикрепите пару покровных колпачков к монтажному слайду. Для получения изображений образцов используйте составной флуоресцентный или конфокальный микроскоп. На этих изображениях показаны передний и задний виды одной и той же взрослой дрозофилы.

Ядра клеток визуализировали с помощью окрашивания DAPI, а нейроны помечали с помощью паннейронального маркера и антител против ELAV. Дофаминергические, или DA, нейроны были выявлены с помощью окрашивания анти-TH антителами. Аналогичные уровни интенсивности наблюдались между обоими полушариями мозга для всех каналов изображения.

Увеличенное изображение передней и задней части мозга позволяет детально изучить кластеры нейронов DA. Парный переднемедиальный кластер можно увидеть на передних изображениях, а парные заднемедиальные и парные задние боковые кластеры — в задней части мозга. Количественная оценка этих нейронов показала, что трехдневные самцы мух штамма w1118 обычно имеют 27 нейронов DA в кластере PPM во всем мозге, 16 в кластере PPL на полушарие и пять в кластере PAL на полушарие.

В среднем 97 нейронов DA было обнаружено в каждом из кластеров PAM, clusters. 3D реконструкция кластеров PAL и PAM также показала, что нейроны DA в кластере PAM имеют относительно небольшие размеры и более слабое окрашивание TH, чем в других кластерах, таких как PAL. Все больше исследований сосредоточено на мозге взрослых мух для анализа молекулярных путей и нейронных схем, лежащих в основе высших функций мозга, а также для моделирования заболеваний мозга человека.

В таких исследованиях на основе мозга необходимо будет эффективно подготовить образцы мозга с хорошо сохранившейся морфологией. Это может быть особенно важно при использовании крупномасштабных экранов на основе мозга. Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я изо всех сил пытался удержать мушек в щипцах.

Вместо щипцов с острыми кончиками, которые используют большинство исследователей дрозофилы, Шебна попробовала щипцы с тупыми концами и обнаружила, что так легче препарировать мозг. После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за 10 секунд, если она выполнена правильно. Однажды я препарировал около 100 мозгов шести разных генотипов для одного эксперимента всего за один день.

Хотя эта процедура вскрытия может показаться простой, важно сначала попрактиковаться в ней с ненужными мухами. Исследователь также может испытывать трудности с позиционированием щипцов без разрушения мозга мухи. Препарированный мозг может быть использован для других исследований, таких как РНК, гибридизация in situ и извлечение образца белка и РНК из ткани мозга.

После просмотра этого видео вы сможете препарировать мозг мухи с хорошо сохранившейся морфологией. Мы прогнозируем, что могут быть разработаны улучшения, чтобы сделать эту процедуру проще и быстрее. В будущем это может быть автоматизировано для крупномасштабных исследований.

Не забывайте, что работа с параформальдегидом и острыми рассекающими щипцами может быть опасной. Примите меры предосторожности, такие как ношение перчаток, при работе с фиксирующими растворами, и как только вскрытие будет завершено, немедленно закройте щипцы колпачками, прежде чем отложить их в сторону.