Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых

Общая цель данного протокола — описать простую одноэтапную процедуру диссекции мозга взрослых мух Drosophila, которая позволяет быстро получить образцы мозга с хорошо сохраненной морфологией, подходящей для анализа целых препаратов. Этот метод может помочь в решении вопросов в области нейронаук и генетики, включая детальное картирование нейронных цепей мозга, изучение эффектов генетических манипуляций с нейронами и функциональную характеристику генов.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он включает в себя простую в освоении процедуру. С его помощью можно выделить мозг взрослой мухи с хорошо сохраненной морфологией менее чем за 10 секунд. Видеодемонстрация данного метода имеет решающее значение, так как контроль необходимого импульса при отпускании пинцета для отрывания экзоскелета, окружающего голову мухи, требует определенных навыков и практики.

Эти крошечные, надоедливые плодовые мушки многому научили нас в области биологических принципов. Они также могут помочь нам найти причины и способы лечения заболеваний человека, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Используя диссекционный микроскоп с увеличением 1,2 X, зафиксируйте обезболивающую мушку и погрузите ее в холодный раствор для диссекции брюшком вверх.

Держите пинцет под углом от 160 до 170 градусов по отношению к препарировочной пластине, затем приложите небольшое усилие к брюшку мухи. Это должно иммобилизовать муху, отвести голову назад на 15–25 градусов и вытянуть хоботок вверх. После этого маневра под хоботком должна стать видна мягкая полупрозрачная область кутикулы.

Увеличьте увеличение и настройте фокальную плоскость на эту область. Доминирующей рукой возьмите диссекционные пинцеты и сожмите их кончики. Расположите пинцет перпендикулярно пинцету, удерживающему муху.

Проколите закрытыми кончиками пинцета мягкую полупрозрачную область кутикулы, стараясь не погружать их слишком глубоко, чтобы не задеть мозг. Затем быстрым, но уверенным движением разожмите пинцет, чтобы его кончики раскрылись, разрывая экзоскелет головы мухи. Используя инерцию при раскрытии кончиков пинцета, аккуратно удалите экзоскелет, а также большую часть головного капсулы вместе с прилегающим глазом и трахеей от мозговой ткани одним плавным движением.

Теперь должен стать виден целый мозг. С помощью пинцета осторожно удалите оставшиеся вспомогательные ткани, такие как белая волокнистая ткань трахеи, стараясь не тянуть и не повредить сам мозг. Поместите диссецированные образцы мозга вместе с соответствующими туловищами примерно в один миллилитр 4% параформальдегида на льду на 40–60 минут.

Удалите параформальдегид, затем промойте образцы одним миллилитром 1X PBS, трижды прокачивая раствор пипеткой, стараясь не аспирировать головной мозг. Затем удалите PBS и проведите пять промывок одним миллилитром 1X PBT по пять минут каждая при нутации. Добавьте соответствующий первичный антитело в нужном разведении.

Затем инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 °C в режиме нутации. Удалите первичные антитела и промойте образцы пять раз, используя по 1 mL 1X PBT, по 5–10 минут на каждую промывку в режиме нутации. Добавьте вторичные антитела к промытым образцам в соответствующем разведении и на необходимое время инкубации.

После этого шесть раз промойте образцы в 1 мл 1X PBT по 10 минут каждый раз при нутации. Этот этап критически важен для удаления любых неспецифически связавшихся вторичных антител. Инкубируйте образцы в растворе DAPI в разведении от 1 к 10 000 (исходная концентрация 1 мг/мл) в 1 мл раствора 1X PBT в течение 30–60 минут при нутации.

В завершение промойте образцы, добавив 1 mL 1X PBS, после чего трижды перемешайте раствор, всасывая и вытесняя его пипеткой. Поместите покровное стекло на предметное стекло. С помощью пипетки с обрезанным наконечником перенесите мозг в растворе 1X PBS на покровное стекло.

Затем с помощью пинцета отделите головной мозг от тела. Используйте наконечник тонкого дозатора, чтобы удалить жидкость вокруг тканей мозга. После этого добавьте от 20 до 40 µL антифейдингового фиксирующего средства.

Осторожно раздвиньте ткани мозга, вытесняя вязкую среду к краям. Начиная с одной стороны, аккуратно опустите второе покровное стекло на образцы, стараясь свести к минимуму контакт тканей мозга с пузырьками воздуха. Дайте стеклам осесть, после чего удалите излишки жидкости с краев стекол с помощью лабораторной салфетки.

С помощью небольшого кусочка клейкой ленты временно закрепите пару покровных стекол на предметном стекле. Для получения изображений образцов используйте световой флуоресцентный или конфокальный микроскоп. На этих изображениях представлены передний и задний ракурсы одной и той же взрослой особи Drosophila.

Ядра клеток были визуализированы с помощью окрашивания DAPI, а нейроны были помечены с использованием пан-нейронального маркера и антител к ELAV. Дофаминергические (DA) нейроны были выявлены путем окрашивания антителами к TH. Для всех каналов изображений наблюдался схожий уровень интенсивности с обеих сторон мозга.

Увеличенные изображения передней и задней частей мозга позволяют детально изучить кластеры дофаминергических (DA) нейронов. Парный передний медиальный кластер виден на изображениях передней части, а парные задние медиальные и парные задние латеральные кластеры — в задней части мозга. Количественный анализ этих нейронов показал, что у трехдневных самцов мух линии w1118 в целом мозге обычно имеется 27 DA-нейронов в кластере PPM, по 16 в кластере PPL на каждое полушарие и по пять в кластере PAL на каждое полушарие.

В каждом из кластеров PAM наблюдалось в среднем 97 DA-нейронов. 3D-реконструкция кластеров PAL и PAM также показала, что DA-нейроны в кластере PAM имеют относительно меньший размер и более слабое окрашивание на TH по сравнению с нейронами других кластеров, таких как PAL. В последнее время всё больше исследований фокусируются на мозге взрослых мух для изучения молекулярных путей и нейронных цепей, лежащих в основе высших функций мозга, а также для моделирования заболеваний головного мозга человека.

Для подобных исследований мозга потребуется эффективная подготовка образцов мозга с хорошо сохраненной морфологией. Это может быть особенно важно при проведении крупномасштабных скринингов тканей мозга. Идея этого метода возникла у меня, когда я столкнулся с трудностями при удержании мух пинцетом.

Вместо пинцетов с острыми концами, которые используют большинство исследователей Drosophila, Шебна попробовала использовать пинцеты с тупыми концами и обнаружила, что препарировать мозг стало проще. При должном навыке эта процедура занимает менее 10 секунд, если выполнять ее правильно. Однажды мне удалось препарировать около 100 экземпляров мозга шести различных генотипов для одного эксперимента всего за один день.

Хотя эта процедура диссекции может показаться простой, важно сначала потренироваться на незаменимых мухах. Исследователю также может быть трудно правильно расположить пинцет, не повредив мозг мухи. Диссекированные мозги можно использовать для других исследований, таких как анализ РНК, гибридизация in situ, а также экстракция белка и образцов РНК из ткани мозга.

После просмотра этого видео вы сможете проводить диссекцию мозга мухи с хорошим сохранением морфологии. Мы полагаем, что возможна разработка усовершенствований, которые позволят сделать эту процедуру более простой и быстрой. В будущем это потенциально может быть автоматизировано для крупномасштабных исследований.

Не забывайте, что работа с параформальдегидом и острыми диссекционными пинцетами может быть опасной. Соблюдайте меры предосторожности, такие как использование перчаток при работе с фиксирующими растворами, и по завершении диссекции немедленно накройте пинцеты колпачками, прежде чем отложить их в сторону.