Подготовка Разработка и взрослых Drosophila Мозги и сетчатки для живых изображений

В этом видео я продемонстрирую, как подготовить мозг и сетчатку глаза к визуализации в реальном времени и иммуногистохимии с акцентом на фоторецепторные клетки. Во-первых, я покажу вам, как подготовиться к вскрытию мозга. Затем я продемонстрирую три различных вскрытия: мозг взрослого человека, сетчатку глаза взрослого человека и развивающийся глаз.

Для каждого из них ткань может быть зафиксирована для иммуногистохимии или визуализированной жизни. Наконец, я опишу, как мы визуализируем живые ткани, и покажу несколько примеров визуализации в реальном времени с помощью резонансной сканирующей конфокальной микроскопии. Итак, приступим.

Для хороших секций вам понадобятся острые щипцы. С помощью точильного бруска или очень мелкой наждачной бумаги аккуратно проведите щипцами вперед и назад с каждой стороны, пока концы не встретятся. В тонком месте мы используем стандартный точильный камень.

Я не буду здесь останавливаться на технике заточки, но скажу, что острые щипцы необходимы для живых вскрытий. Каждый день мы затачиваем щипцы для вскрытия мозга у взрослых. Поместите мух на подушечку с CO2, чтобы обезболить их и отсортировать нужный генотип.

Для вскрытия зрачков просто загляните во флакон и осторожно удалите зрачок щипцами, стараясь не сломать корпус зрачка. Возьмите в пух и промойте ким, смочите его водой. Вы будете использовать его во время вскрытия, чтобы удалить мусор из щипцов.

Установите препарирующую чашку на столик стереоскопа и заполните ее раствором HL three. Все вскрытия будут проводиться в HL 3, чтобы гарантировать, что ткань останется живой и здоровой во время процедуры диссекции. Кроме того, мне нравится использовать диссекционную чашку с нижним покрытием из защитного кожуха Syl для защиты щипцов во время вскрытия.

Теперь приготовьте раствор для фиксации. Если планируется проведение иммуногистохимии. Поместите 180 микролитров HL three в микроцентрифужную пробирку объемом 500 микролитров.

Добавьте 20 микролитров 37% формальдегида, чтобы получить 3,7% раствор формальдегида. Наконец, правильное положение рук важно для хорошего рассечения с хорошим положением рук. Ваши щипцы будут устойчивыми и способны к контролируемым тонким движениям.

Сначала поместите щипцы по бокам большого пальца, затем опустите указательный палец прямо вниз так, чтобы кончик пальца упирался сверху. Теперь положите сторону щипцов на сторону среднего пальца и перейдите к тарелке для вскрытия. Сделайте физический контакт с тарелкой большим и средним пальцами, положив большой и средний пальцы на тарелку.

Поставьте запястье на предметный столик микроскопа. Сюда. Во время рассечения у вас есть три точки, прочно прилегающие к поверхности, и теперь можно делать только очень тонкие манипуляции с щипцами.

На подушке с CO2. Ориентируйте взрослую муху брюшной стороной вверх головой в сторону от руки. Возьмитесь за грудную клетку чуть ниже головы.

Если все сделано правильно, ноги и зонд будут вытягиваться при просмотре под стереоскопом, захватите вытянутые пробо щипцами, чтобы удалить голову, выбросьте тело и погрузите голову в воду. Перефокусируйтесь на погруженную голову. Вся диссекция будет проводиться под раствором.

Очень важно все время удерживать щипцами голову. В противном случае голова будет плавать. И помните, плавающую головку всегда трудно достать.

Если во время вскрытия головка выходит из фокуса, просто переместите ее обратно в фокальную плоскость, не настраивая микроскоп. Эта, казалось бы, простая задача поначалу может показаться сложной, но со временем держать голову в фокусе станет проще. Начните диссекцию с разрыва соединительной ткани между зондом и глазом.

Прорвите глаз, крепко удерживая хотя бы одним щипцом. Убедитесь, что палец ноги щипцов находится чуть ниже сетчатки или кутикулы. Чтобы не повредить мозг под ней, чередуйте левое и правое.

С помощью щипцов оторвите сетчатку, двигаясь к затылку. Отрыв сетчатки увеличит вероятность того, что пластинка останется прикрепленной к зрительной доле. На протяжении всего этого вскрытия продолжайте движение по затылку, попутно разрывая кутикулу, прорвите другой глаз и начните оттягивать кутикулу.

Пока вы хватаете кутикулу, вы знаете, что не раздавливаете мозг. Помня об этом, продолжайте оттягивать кутикулу и сетчатку до тех пор, пока мозг не обнаружится. Как только мозг станет виден, можно приступать к удалению трахеи, прикрепленной к мозгу, продолжать подтягивать ее, трахею и кутикулу до тех пор, пока мозг не будет изолирован.

На этом этапе вы должны переместиться на дно чашки для выполнения оставшихся этапов визуализации фоторецепторных терминалей. Желательно сохранить пластинку, но нужно удалить сетчатку, в которой находятся клеточные тела и сильно аутофлуоресцентный пигмент. Для этого нужно аккуратно потянуть за кустистые остатки тела клетки, не повреждая пластинку.

Это более тонкий навык, который требует практики. Удалите оставшуюся трахею Поскольку в противном случае ваш мозг может плавать во время ночных промываний антителами, мозг взрослого человека может оставаться живым в течение нескольких часов или даже ночи при использовании условий, о которых я расскажу в разделе 7. Для иммуногистохимии мозг взрослого человека теперь готов к фиксации и формальдегиду.

Используйте пипетку P 20 объемом пять микролитров, чтобы переместить мозг взрослого человека к уже приготовленному раствору для фиксации. Продолжайте препарировать мозг взрослого человека в течение 20 минут, что должно дать от четырех до 10 мозгов. Оставьте мозги и закрепите еще на 40 минут.

Однако эта продолжительность может варьироваться. Для оптимального окрашивания первичных антител удалите раствор формальдегида и промойте мозг три раза по пять минут и 400 микролитрами раствора, содержащего PBS и 0,4% TRITTON X 100, далее именуемые PBS Triton. После полного вымывания зафиксированного раствора можно добавить первичный раствор антител.

Начните это вскрытие так, как описано для мозга взрослого человека После погружения головы и перефокусировки микроскопа начните с разрыва соединительной ткани между зондом и глазом над зондом. Отделите кутикулу от глаза. Теперь отделите кутикулу от нижней части глаза, двигаясь к затылку одним щипцом.

Возьмитесь за центр затылка для этого рассечения. Можно раздавить мозг другими щипцами. Возьмитесь за глаз и раздвиньте.

Дайте глазу осесть на дно блюда. Пластинка, вероятно, по-прежнему будет прикреплена к глазу и может быть использована для визуализации фоторецепторных окончаний полностью неповрежденных фоторецепторных клеток в реальном времени. В следующих трех разделах объясняется, как подготовить глаз к иммуногистохимии.

Для проведения иммуногистохимии переместите глаз на фиксирующий раствор. С помощью трубки P 20 Petman установите на пять микролитров, продолжайте препарировать глаза взрослого в общей сложности 10 минут. Оставьте глаза и зафиксируйте еще на 30 минут.

Удалите неподвижный раствор и проведите промывания, как описано в разделе Вскрытие мозга у взрослых. Если вы в конечном итоге хотите получить изображение материальной структуры глаза, то его необходимо удалить. Теперь верните неподвижные глаза в чашку для препарирования и удалите все трахеи или жировые клетки, которые все еще могут прикрепиться.

Затем, удерживая внешнюю сторону глаза одним щипцом, удалите пластинку другим. Он должен оторваться целиком, обнажив клеточные тела под ним. Будьте осторожны и захватывайте только пластинку В противном случае вы рискуете оторвать тела клеток от сетчатки.

С помощью трубки P 20 Eman переместите в глаза 400 микролитров PBS Triton в 500 микролитров пробирки. Осторожно покачивайте их при температуре четыре градуса на ночь, чтобы на следующий день удалить автофлуоресцентный красный пигмент из фоторецепторов. Вы можете отказаться от раствора для промывки и добавить в него первичный раствор для визуализации глаз взрослого человека без пластинки.

Мы используем только взрослых мух-хорьков, которые находятся на поздней стадии незадолго до эло. На этом этапе тела фоторецепторных клеток отделяются от окончаний в пластинке во время рассечения. Взрослые пюи имеют четко очерченные крылья, глаза и кутикулу, видимые через зрачок.

Выберите куколку и погрузите ее в HL три. Удалите переднюю часть зрачка, чтобы обнажить область головы. Аккуратно снимите тонкую внутреннюю оболочку, которая дополнительно обволакивает развивающуюся муху.

Возьмитесь щипцами за основание головы и потяните. Выбросьте остальную часть куколки, сохраняя при этом голову погруженной. Действуйте, как описано в разделе Вскрытие глаза для иммуногистохимии на стадии взрослого человека.

Тем не менее, тела фоторецепторных клеток будут легче отделяться от пластинки, что позволит вам визуализировать клеточные тела, расположенные в сетчатке. Кроме того, пластинка остается прикрепленной к зрительной доле, что позволяет визуализировать дистальный отдел пластинки. Если вы хотите получить изображение проксимальной пластинки, где можно увидеть фоторецепторные концевые картриджи, то проведите вскрытие глаза взрослой мухи, где пластинка более прочно прикреплена к глазу.

Развивающийся глазной диск с 20% развитием зрачка стал фаворитом для визуализации в реальном времени в нашей лаборатории. Потому что этот единственный слой относительно крупных развивающихся клеток легко наблюдать с помощью конфокальной микроскопии. Чтобы выбрать 20%-ную куколку, ищите канальцы Яна, зеленое пятно, которое появляется под зрачком, и избегайте кукол с темным телом, которое образуется после 20%-ного развития зрачка.

Выбрав куколку, погрузите ее в HL 3 в чашку для препарирования и осторожно удалите переднюю часть зрачкового мешка. Будьте осторожны, чтобы не проникнуть в тонкую внутреннюю оболочку. Возьмитесь за внутреннюю мембрану щипцами и раздвиньте.

Внимательно изучите высвобожденное содержимое, чтобы найти развивающиеся диски мозга и глаза, которые довольно заметны. Изолируйте мозг на дне тарелки для препарирования. Осторожно отделите центральный мозг от зрительной доли.

Дисковый комплекс зрительной доли I будет использоваться для визуализации в режиме реального времени. Если вы хотите визуализировать ткань в течение короткого периода времени только одним или двумя растворами, вы можете визуализировать свою ткань на предметном стекле. В этом случае подготовьте предметное стекло, предварительно покрыв поверхность силгардом в соответствии с инструкцией производителя.

Поместите 20 микролитров HL три. В середине предметного стекла перенесите рассеченную ткань в 20 дополнительных микролитрах HL три на предметное стекло. Ткань ни в коем случае не должна подвергаться воздействию воздуха.

Кроме того, необходимо избегать любого напряжения или напряжения при работе с пипеткой. Для визуализации в реальном времени ткань должна быть надежно закреплена. Приобретите стеклянный электрод, подобный тем, которые вытягиваются для электрофизиологической записи.

Отломайте кончик и заполните конец клеевым стежком с использованием отрицательного давления воздуха, создаваемого ртом, отломите только столько электрода, чтобы клей мог войти. Теперь с помощью положительного нажима нанесите небольшое количество клея на защиту порога под каплю HL три. Теперь быстро закрепите ткань на клее, сохраняя нужную ориентацию для создания изображений в реальном времени.

Теперь для визуализации можно использовать водную погружную линзу. Если вы хотите добавить мембранный проницаемый краситель, вы можете добавить его в ванну. При визуализации для визуализации в течение длительных периодов времени или для полной или многократной замены растворов мы используем перфузионную камеру, которая подключается к перистальтическому насосу, медленно просматривающему культуральный раствор по живой ткани.

Используйте чехол, покрытый каплей защитного кожуха, который выбрит, чтобы сделать его тонким и плоским. Выдавите 20 микролитров HL three на центр крышки. Наденьте и приклейте живую ткань к защитному кожуху порога.

Создайте прокладку, которая позволит пузырькам проходить через камеру, не подвергая живую ткань воздействию воздуха. Прокладка должна быть достаточно толстой, чтобы избежать раздавливания ткани, но достаточно тонкой, чтобы приблизить ткань к линзе конфокального микроскопа. Соберите камеру для обильности, стараясь постоянно держать ткань полностью погруженной.

Таким образом, обмен растворов может производиться со скоростью до 100 микролитров в минуту. Для визуализации в масштабе часов вам, возможно, придется добавить 20 гидрокси Дайсона и антибиотик, но не противогрибковый, и выполнять обильное введение с гораздо более медленной скоростью, около 10 микролитров в минуту. Кроме того, мы вводим кислород в питательную среду, которая снабжает перистальтический насос.

Теперь у вас есть все навыки, необходимые для успешного вскрытия мозга и сетчатки глаза дрозофилы. Кроме того, вы можете визуализировать живые развивающиеся глазные диски или взрослые фоторецепторы. Так что спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.