Применение методики многоцветной FlpOut для изучения морфологии одноклеточного высокого разрешения и взаимодействия клеток глии в дрозофилы

Общая цель этого метода заключается в визуализации морфологии отдельных клеток в сложных анатомических тканях, что упрощает изучение клеточного взаимодействия у дрозофил. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся сложной морфологии и клеточных взаимодействий с использованием плодовой мушки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть адаптирована для изучения морфологии отдельных клеток в любой ткани и на любой стадии развития.

Демонстрировать процедуру будет Аня Кизер, техник нашей лаборатории. Метод MCFO модифицирует стандартный метод FlpOut следующим образом. Тепловой шок FLP рекомбиназы и разные репортеры остаются под контролем БАС, однако у каждого репортера есть общая костяк миристоилированной суперпапки GFP, в которую были вставлены копии эпитопного тега.

Полученные нефлуоресцентные белки называются спагетти-монстрами GFP и идентифицируются с антителами. В зависимости от количества иссечений выражается различная комбинация эпитопов. Поскольку промотор СЧЛ слабо активен при температуре 25 градусов по Цельсию, устанавливайте кресты при температуре 18 градусов по Цельсию там, где он действительно неактивен.

Затем подождите около 20 дней, чтобы получить поколение F1. Отсортируйте самок и самцов F1 по отдельным флаконам. Чтобы вызвать тепловой шок, сначала переложите их в флаконы со свежими продуктами, когда им исполнится три-четыре дня.

Молодые мухи могут быть слишком нежными для теплового удара. Далее переложите флаконы на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия. Погрузите их глубоко в воду, чтобы обеспечить однородный тепловой шок.

Для разреженной маркировки глиальных клеток начните с пяти-восьми минут теплового шока, а затем оптимизируйте. Оптимальное время теплового шока будет разреженно маркировать целевые ячейки, и его соотношение зависит от конкретного используемого драйвера GAL4. После теплового удара положите флаконы горизонтально на скамейку на несколько минут, чтобы они остыли.

Теперь начните поддерживать температуру мух при температуре 25 градусов по Цельсию в тех же флаконах. Через два дня сцеживание репортеров будет оптимальным, и мух можно будет препарировать. В процессе подготовки ставим на лед три скважины глубокой депрессии.

Заполните одну лунку 70%-ным этанолом, одну PBS и одну питательной средой S2. Затем загрузите трехсантиметровую рассекающую тарелку, выстланную черным силиконом, холодным S2. Проводите полное вскрытие в S2, чтобы сохранить ткани здоровыми. Теперь обезболите мух углекислым газом.

Затем, используя щипцы или перо, поместите мух в холодный 70%-ный этанол примерно на 30 секунд, затем в холодный PBS примерно на 30 секунд, а затем переложите их в холодный S2. Таким образом, вымойте всех мух, подлежащих препарированию. Обычно достаточно до 10 мух одного генотипа. Теперь, в течение 30 минут, препарируйте все мозги.

Во-первых, отделите голову от остального тела и выбросьте тело. Держите голову открытой рукой на протяжении всего вскрытия, иначе будет очень трудно восстановить контроль над ней. Затем вытяните один глаз, захватив ткань чуть ниже сетчатки.

Затем оттяните другой глаз и таким образом обнажите мозг и окружающие ткани. Затем удалите всю ткань трахеи и оставшуюся кутикулу вокруг мозга, пока мозговая ткань не станет чистой. Для достижения оптимальных результатов окрашивания необходимо удалить всю ткань трахеи.

Это все, что нужно для подготовки мозга к фиксации. Приступайте к препарированию всех мозгов, сохраняя при этом препарированные мозги в холодном S2. Постарайтесь, чтобы на одну микроцентрифужную пробирку было подготовлено до 10 мозгов для оптимального окрашивания. Перенесите изолированный мозг с помощью наконечника для пипетки P10 в микроцентрифужную пробирку объемом 200 микролитров с фиксирующим раствором.

Никогда не обрабатывайте мозг с помощью щипцов. Инкубируйте ткани, защищенные от света. Избегайте аспирации мозга во время переноса раствора.

Чтобы снять фиксатор, используйте три или более 15-минутных промывки с моющим раствором. Затем заблокируйте ткани блокирующим раствором на 30 минут или дольше. Далее замените блокирующий раствор первичными антителами, разведенными в растворе для промывки, и инкубируйте мозг в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

Чтобы удалить первичные антитела, используйте три одночасовых полоскания в растворе для умывания. Далее добавьте вторичные конъюгированные антитела флуорофора в раствор для промывки и инкубируйте мозг в течение ночи при четырех градусах Цельсия или в течение четырех часов при комнатной температуре. Чтобы полностью смыть несвязанные антитела, используйте три одночасовых полоскания в растворе для промывки, а затем более длительное полоскание PBS.

Затем монтируем мозги. Подготовьте два покровных листа с воображаемой распоркой. В распорку и на дополнительное защитное стекло нанесите 10 микролитров монтажной среды с средством, препятствующим выцветанию.

Затем с помощью пипетки P10 перенесите мозги на покровную пластинку, поместив их рядом со средой вместе с небольшим количеством PBS. Не допускайте пересыхания тканей. Теперь осторожно переместите мозги в монтажную среду с помощью пипетки и, наконец, переместите их в среду в спейсере и расположите их щипцами.

Затем снимите клейкий вкладыш с распорок и прикрепите крышку. Зафиксируйте крышку с небольшим давлением с помощью щипцов и немедленно приступайте к визуализации или храните предметные стекла при температуре минус 20 градусов Цельсия для последующего анализа. Используя описанные методы, три различных мембранных меченных репортера замалчиваются транскрипционными терминаторами, окруженными сайтами FRT.

Когда животные подвергались тепловому шоку, рекомбиназа FLP экспрессировалась и случайным образом удалялась терминаторами, что приводило к экспрессии различных комбинаций репортеров. В целом, различные комбинации репортеров обеспечивают семь различных цветов, таким образом, несколько морфологий отдельных клеток могут быть визуализированы и изучены по отдельности. С помощью EG-GAL4 и ALG-GAL4 были протестированы различные периоды теплового шока.

Было проанализировано мечение одиночных клеток в области антенной доли мозга. Драйвер EG-GAL4 экспрессируется в оболочке глиальных клеток, которые все расположены на поверхности антеннальной доли. Для сравнения, астроцитоподобная глия, на которую нацелен ALG-GAL4, покрывала в основном неперекрывающиеся участки антеннальной доли.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как маркировать одиночные клетки в растворе. Для того чтобы понять их сложные и анатомические взаимосвязи с помощью дрозофил и в принципе и на модельном организме, в котором может быть применена бинарная система GAL4 UIS. Пробуя эту процедуру впервые, важно сначала помнить о необходимости оптимизировать время теплового шока и максимально следовать отдельным шагам протокола окрашивания, чтобы получить наилучшие результаты.