Субретинальная трансплантация macS Очищенные клетки-предшественники фоторецептора в сетчатку взрослой мыши

Общей целью данного эксперимента является трансплантация обогащенных клеток-предшественников фоторецепторов в сетчатку мыши-реципиента. Это достигается путем выделения сначала сетчатки глаза молодых животных-доноров. На втором этапе постнатальные клетки-предшественники фоторецепторов выделяют из популяции клеток сетчатки с помощью магнитной сортировки ассоциированных клеток на основе CD 73.

Затем предшественники фоторецепторов трансплантируются в субретинальное пространство животных-реципиентов, чтобы облегчить их интеграцию в сетчатку реципиента. В конечном счете, интеграционный потенциал и поведение трансплантированных клеток-предшественников фоторецепторов могут быть проанализированы с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации сетчатки, например, какова способность трансплантированных фоторецепторов интегрироваться в нейронную схему хозяина для восстановления зрения.

Применение этого метода выходит за рамки лечения дегенеративных заболеваний сетчатки. После того, как установка и обогащение предшественников фоторецепторов в максимальной степени может быть легко адаптировано к условиям GMP, визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Начните с краткого ополаскивания голов детенышей четвертого дня после рождения в 70% этаноле, а затем промойте их PBS.

Затем перенесите головы в холодный HBSS, чтобы зародить глаза для каждого глаза. Сначала откройте веко. Затем с помощью пары изогнутых щипцов.

Возьмитесь за орган в области зрительного нерва и осторожно вытяните глаз из орбиты. Далее, чтобы изолировать сетчатку, введите кончик закрытых ножниц в зрительный нерв и раскройте лезвия. Удалите пигмент сетчатки, эпителий, сосудистую оболочку и с помощью изогнутых щипцов удалите хрусталик и сосуды.

Инкубируйте изолированные сетчатки в 1,5-миллилитровой реакционной пробирке, содержащей раствор папаина, в течение 30-60 минут в шейкере при 400 об/мин и 37 градусах Цельсия. Во время инкубации сетчатки налейте один миллилитр раствора OVO moid в 15-миллилитровую реакционную пробирку, помеченную одну, затем в двухмиллилитровую реакционную пробирку, помеченную двумя по 60 микролитров ДНК, одним 60 микролитрами раствора OVO MOID и 520 микролитрами EBSS. После инкубации раствор папаина, содержащий частично переваренную сетчатку, переносят во вторую реакционную трубку, а затем 10 раз перебирают сетчатку с помощью отполированной огнем пипетки.

Аккуратно нанесите суспензию одиночных клеток поверх раствора OVO MOID в реакционную пробирку номер один и центрифугируйте раствор клетки в течение пяти минут при 300 G и комнатной температуре. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах максимального буфера. Для сортировки по максимуму сначала инкубируйте клетки по 10 мкг на миллилитр антител крысы против CD 73 на льду.

Через пять минут промойте клетки в 10 миллилитрах макс буфера. Затем ресуспендируйте гранулу в 480 микролитрах максимального буфера и инкубируйте клетки в 120 микролитрах микрогранул go anti RET IgG на льду без перемешивания, встряхивания или перемешивания. Через 15 минут промойте ячейки в пяти миллилитрах максимального буфера во время промывки, поместите колонку LS на максимальный магнит и поставьте фильтр предварительного разделения поверх колонки.

Далее увлажните фильтр и колонку тремя миллилитрами максимального буфера. Собираем буфер в 15 миллилитровую пробирку с маркировкой W для стирки. Когда ячейки закончат вращаться, снова суспендируйте гранулу в 500 микролитрах максимального буфера и выгрузите ячейки в фильтр.

Добавьте один миллилитр максимального буфера поверх клеток, а затем соберите отрицательную фракцию в 15-миллилитровую реакционную пробирку с пометкой «минус» для отрицательных. Далее добавьте три миллилитра макс буфера в колонку три раза, чтобы промыть ее. Теперь снимите колонку с магнитной стойки.

Установите его сверху на 15-миллилитровую реакционную пробирку с маркировкой «плюс» для положительного результата. И быстро загружаем в колонку пять миллилитров максимального буфера. Пропустите весь буфер через колонну, а затем, после вращения положительной фракции, снова суспендируйте гранулу в 500 микролитрах максимального буфера.

Поместите ячейки при температуре четыре градуса Цельсия и посчитайте их. Затем отрегулируйте концентрацию до двух умно-10 до пятой части клеток на микролитр в максимальном буфере, поддерживая клетки на уровне четырех градусов Цельсия для трансплантации выделенных клеток-предшественников фоторецепторов, расширяют зрачки взрослой мыши, усыпленной седативной жидкостью, каплей фенила левого вентиляционного тропического чаида, в то время как зрачки расширяются. С помощью алмазной ручки разрежьте предметное стекло примерно на пять на пять миллиметров.

Поместите мышь под стереомикроскоп, задержите животное в держателе для головы мыши, а затем нанесите каплю геля ICIC на каждый глаз, чтобы предотвратить высыхание. Теперь с помощью полудюймовой иглы 30 калибра сделайте небольшое отверстие на границе между склерой и роговицей. Затем поместите одну из крышек размером пять на пять миллиметров на верхнюю часть роговицы, что позволит напрямую визуализировать сетчатку.

Далее несколько раз промойте предварительно стерилизованный микролитровый шприц стерильной деионизированной водой, а затем загрузите в шприц одну из отсортированных клеточных суспензий. Направьте иглу по диагонали через конъюнктиву и склеру, поместив ее в носовую половину сетчатки. Затем аккуратно проделайте отверстие через сетчатку в субретинальном пространстве и введите клетки.

Подтвердите буллезную форменную отслойку сетчатки, которая должна покрывать примерно четверть пространства сетчатки без какого-либо кровотечения. Затем аккуратно извлеките шприц и еще несколько раз промойте его ионизированной водой. Наконец, освободите мышь от ограничителя.

Введите животному гидрохлорид масла амаз, чтобы обратить вспять действие анестезии и дать ему восстановиться в темноте камеры при температуре 25 градусов по Цельсию, чтобы оценить способность палочковых фоторецепторов встраиваться в сетчатку мыши Была использована мышиная репортерная линия, в которой GFP управляется нейронной сетчаткой, теряющей молнию, или промотором NRL, как показано на этих гистограммах. Исходная суспензия клеток сетчатки содержала 30,4% GFP-положительных фоторецепторов палочек.

После CD 73 максимальная сортировка и обогащение до 86,9% клеток-предшественников фоторецепторов GFP наблюдались в CD 73 положительной фракции в CD 73 отрицательной фракции. Только 9,9% клеток были положительными на GFP. Также наблюдается обогащение N-R-L-G-F-P положительных клеток после CD 73 based max.

После осаждения in vitro донорские клетки остаются в месте инъекции, как это определено буллезной отслоившейся сетчаткой хозяина, и интегрируются во внешний ядерный слой сетчатки хозяина, приобретая морфологию зрелых фоторецепторов. После того, как вы освоите магнитные ассоциированные клетки, сортировка может быть выполнена в течение двух часов, если она верна. Договорились. Эта процедура также может быть адаптирована для обогащения фоторецепторов, полученных из стволовых клеток, или даже других стволовых клеток сетчатки.

Учитывая наличие специфических антител, можно ответить на дополнительные вопросы, касающиеся восстановления или спасения путем трансмутации клеток сетчатки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить пересадку. Фотомакс обогащает клетки-предшественники фоторецепторов в этом субретинальном пространстве мышей-реципиентов.