Выделение и характеристика мезенхимальных стромальных клеток из пуповинной и фетальной плаценты

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы изолировать мезенхимальные стромальные клетки из четырех различных источников перинатальной ткани: слизистой оболочки пуповины, желе Уортона, соединения пуповины и плаценты и плаценты плода. Этот метод может помочь продвинуться в области биологии стволовых клеток, альтернативной медицины путем получения мезенхимальных стволовых клеток особого качества, неинвазивным способом. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет продуктивно получать большое количество высококачественных однородных клеточных популяций из различных перинатальных источников тканей.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки спинного мозга, полученные с помощью этой методики, могут быть использованы для лечения различных заболеваний и расстройств, поскольку они более примитивны, чем мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из тканей взрослого человека. Этот метод может дать представление о характеристиках мезенхимальных стромальных клеток из разных сегментов и конкретных ниш спинного мозга и плаценты. Начните с того, что поместите образец в 150-миллиметровую чашку Петри на льду в шкафу биологической безопасности и с помощью иглы и шприца несколько раз промойте ткань ледяным PBS.

Когда все сгустки крови будут удалены, тщательно исследуйте образец, чтобы определить различные анатомические области. Затем с помощью щипцов обхватите плодный конец пуповины и с помощью ножниц аккуратно сделайте разрез в верхней части соединения пуповины с плацентой. Сделайте второй разрез ниже места соединения, чтобы отделить соединение пуповины и плаценты от плаценты.

И разделите отделенные ткани на отдельные чашки Петри. Затем перережьте пуповину в продольном направлении, чтобы полностью обнажить кровеносные сосуды и окружающее студе Уортона, не нарушая эпителий. С помощью скальпеля соскребите желе Уортона с кровеносных сосудов и межэпителия субамниона.

Затем удалите кровеносные сосуды, перенеся оставшееся периваскулярное желе под кровеносными сосудами и вокруг них в чашку для желе Уортона, и поместите оставшуюся ткань, выстилающую пуповину, в отдельную чашку. Когда все ткани будут препарированы, замените PBS в каждой чашке тремя-пятью миллилитрами трипсина и с помощью ножниц разрежьте каждый образец ткани на один-два миллиметра для 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия и пяти процентах углекислого газа. Используйте фазово-контрастный микроскоп для наблюдения за частичным пищеварением, визуализируя высвобождение клеток из ткани.

По окончании периода частичного разложения нейтрализуют трипсин равным объемом питательной среды и переложите образцы в отдельные конические пробирки объемом 50 миллилитров. Дайте кусочкам салфетки отстояться в течение трех минут. Затем осторожно отсадите надосадочную жидкость и поместите от 15 до 20 частично переваренных кусочков ткани на образец в отдельные колбы для культуры тканей площадью 75 квадратных сантиметров.

Далее добавьте девять миллилитров питательной среды для двух-трехдневной инкубации при 37 градусах Цельсия. Через три дня смените питательную среду и исследуйте растения с помощью фазово-контрастной микроскопии на предмет роста клеток. Когда рост клеток достигнет 70 процентов конфлюенции, диссоциируйте клетки в одном-двух миллилитрах раствора трипсина на колбу, вращая колбу для равномерного покрытия раствором фермента, и инкубируйте культуры в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем нейтрализуют реакцию одним-двумя миллилитрами питательной среды. Соберите клетки центрифугированием, повторно суспендируя гранулу в питательной среде для субкультуры с плотностью посева от 1 до 10-4 клеток на квадратный сантиметр. Клетки из выстилки пуповины и желе Уортона демонстрируют значения эффективности колониеобразования 59 и 80 колоний соответственно.

Однако значение эффективности колониеобразования клеток соединения пуповины и плаценты аналогично тому, которое наблюдается для мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, что позволяет предположить, что клетки, полученные в результате соединения пуповины и плаценты, обладают более высокими способностями к пролиферации и самообновлению. Метрический анализ суспензий одиночных клеток, выделенных из этих перинатальных тканей, показывает, что процентное соотношение положительных клеток к маркерам специфических мезенхимальных стволовых клеток из всех четырех источников тканей аналогично процентному соотношению стандартных мезенхимальных клеток, полученных из костного мозга. Однако медианные коэффициенты интенсивности флуоресценции указывают на то, что желе Уортона и клетки, полученные на основе соединения пуповины с плацентой, очень похожи или выше, чем слизистая оболочка пуповины в клетках, полученных из плаценты плода.

Интересно, что, несмотря на различные значения эффективности колониеобразования, все клетки из разных перинатальных источников экспрессируют сходные уровни маркеров плюрипотентности при количественном анализе RTPCR, за исключением мезенхимальных стромальных клеток, полученных из соединения пуповины и плаценты, которые продемонстрировали самые высокие уровни экспрессии для всех протестированных маркеров плюрипотентности. Кроме того, мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из всех перинатальных источников, легко дифференцируются в адипогенные, хондрогенные и остеогенные типы клеток, а также демонстрируют трехлинейную дифференцировку. Хотя потенциал дифференцировки варьируется в зависимости от источника мезенхимальных стромальных клеток.

После освоения этой техники ее можно освоить за два-три часа, если она выполнена эффективно. При попытке этой процедуры важно практиковать латеральную технику и избегать перекрестного загрязнения между источниками тканей. Этот метод проложил путь исследователям к изучению природы ниш стволовых клеток в перинатальных тканях.