Выделение и характеристика мезенхимальных стромальных клеток из пуповинной и фетальной плаценты
3 апреля 2017 г.
Здесь мы приводим протокол для рассечения пуповины человека (UC) и фетальной образца плаценты в мозге накладки (CL), желе Уортон (WJ), шнур-плацента узел (КЗЖ) и плодной плаценты (ФП) для изоляции и характеристика мезенхимальных стромальных клеток (МСК) с использованием метода эксплантов культуры.
Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы изолировать мезенхимальные стромальные клетки из четырех различных источников перинатальной ткани: слизистой оболочки пуповины, желе Уортона, соединения пуповины и плаценты и плаценты плода. Этот метод может помочь продвинуться в области биологии стволовых клеток, альтернативной медицины путем получения мезенхимальных стволовых клеток особого качества, неинвазивным способом. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет продуктивно получать большое количество высококачественных однородных клеточных популяций из различных перинатальных источников тканей.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки спинного мозга, полученные с помощью этой методики, могут быть использованы для лечения различных заболеваний и расстройств, поскольку они более примитивны, чем мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из тканей взрослого человека. Этот метод может дать представление о характеристиках мезенхимальных стромальных клеток из разных сегментов и конкретных ниш спинного мозга и плаценты. Начните с того, что поместите образец в 150-миллиметровую чашку Петри на льду в шкафу биологической безопасности и с помощью иглы и шприца несколько раз промойте ткань ледяным PBS.
Когда все сгустки крови будут удалены, тщательно исследуйте образец, чтобы определить различные анатомические области. Затем с помощью щипцов обхватите плодный конец пуповины и с помощью ножниц аккуратно сделайте разрез в верхней части соединения пуповины с плацентой. Сделайте второй разрез ниже места соединения, чтобы отделить соединение пуповины и плаценты от плаценты.
И разделите отделенные ткани на отдельные чашки Петри. Затем перережьте пуповину в продольном направлении, чтобы полностью обнажить кровеносные сосуды и окружающее студе Уортона, не нарушая эпителий. С помощью скальпеля соскребите желе Уортона с кровеносных сосудов и межэпителия субамниона.
Затем удалите кровеносные сосуды, перенеся оставшееся периваскулярное желе под кровеносными сосудами и вокруг них в чашку для желе Уортона, и поместите оставшуюся ткань, выстилающую пуповину, в отдельную чашку. Когда все ткани будут препарированы, замените PBS в каждой чашке тремя-пятью миллилитрами трипсина и с помощью ножниц разрежьте каждый образец ткани на один-два миллиметра для 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия и пяти процентах углекислого газа. Используйте фазово-контрастный микроскоп для наблюдения за частичным пищеварением, визуализируя высвобождение клеток из ткани.
По окончании периода частичного разложения нейтрализуют трипсин равным объемом питательной среды и переложите образцы в отдельные конические пробирки объемом 50 миллилитров. Дайте кусочкам салфетки отстояться в течение трех минут. Затем осторожно отсадите надосадочную жидкость и поместите от 15 до 20 частично переваренных кусочков ткани на образец в отдельные колбы для культуры тканей площадью 75 квадратных сантиметров.
Далее добавьте девять миллилитров питательной среды для двух-трехдневной инкубации при 37 градусах Цельсия. Через три дня смените питательную среду и исследуйте растения с помощью фазово-контрастной микроскопии на предмет роста клеток. Когда рост клеток достигнет 70 процентов конфлюенции, диссоциируйте клетки в одном-двух миллилитрах раствора трипсина на колбу, вращая колбу для равномерного покрытия раствором фермента, и инкубируйте культуры в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия.
Затем нейтрализуют реакцию одним-двумя миллилитрами питательной среды. Соберите клетки центрифугированием, повторно суспендируя гранулу в питательной среде для субкультуры с плотностью посева от 1 до 10-4 клеток на квадратный сантиметр. Клетки из выстилки пуповины и желе Уортона демонстрируют значения эффективности колониеобразования 59 и 80 колоний соответственно.
Однако значение эффективности колониеобразования клеток соединения пуповины и плаценты аналогично тому, которое наблюдается для мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, что позволяет предположить, что клетки, полученные в результате соединения пуповины и плаценты, обладают более высокими способностями к пролиферации и самообновлению. Метрический анализ суспензий одиночных клеток, выделенных из этих перинатальных тканей, показывает, что процентное соотношение положительных клеток к маркерам специфических мезенхимальных стволовых клеток из всех четырех источников тканей аналогично процентному соотношению стандартных мезенхимальных клеток, полученных из костного мозга. Однако медианные коэффициенты интенсивности флуоресценции указывают на то, что желе Уортона и клетки, полученные на основе соединения пуповины с плацентой, очень похожи или выше, чем слизистая оболочка пуповины в клетках, полученных из плаценты плода.
Интересно, что, несмотря на различные значения эффективности колониеобразования, все клетки из разных перинатальных источников экспрессируют сходные уровни маркеров плюрипотентности при количественном анализе RTPCR, за исключением мезенхимальных стромальных клеток, полученных из соединения пуповины и плаценты, которые продемонстрировали самые высокие уровни экспрессии для всех протестированных маркеров плюрипотентности. Кроме того, мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из всех перинатальных источников, легко дифференцируются в адипогенные, хондрогенные и остеогенные типы клеток, а также демонстрируют трехлинейную дифференцировку. Хотя потенциал дифференцировки варьируется в зависимости от источника мезенхимальных стромальных клеток.
После освоения этой техники ее можно освоить за два-три часа, если она выполнена эффективно. При попытке этой процедуры важно практиковать латеральную технику и избегать перекрестного загрязнения между источниками тканей. Этот метод проложил путь исследователям к изучению природы ниш стволовых клеток в перинатальных тканях.
Обзор
В данном протоколе описывается процедура диссекции пуповины человека и плаценты плода для выделения мезенхимальных стромальных клеток (МСК) методом эксплантационной культуры. Этот метод позволяет охарактеризовать МСК из различных источников перинатальных тканей, что способствует развитию биологии стволовых клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Регенеративная медицина
- Методы культивирования клеток
Введение
- Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) обладают терапевтическим потенциалом благодаря своей мультипотентности.
- Перинатальные ткани являются богатыми источниками примитивных МСК.
- Данный протокол направлен на увеличение выхода высококачественных МСК из пуповины и плаценты.
- Понимание характеристик МСК из различных тканевых источников может помочь в определении путей их клинического применения.
Цель исследования
- Для выделения МСК из выстилки пуповины, желе Wharton's jelly, места прикрепления пуповины к плаценте и фетальной плаценты.
- Для оценки качества и характеристик МСК, полученных из этих тканей.
- Для предоставления неинвазивного метода получения МСК для исследовательских и терапевтических целей.
Используемые методы
- Диссекция пуповины и плаценты на отдельные анатомические области.
- Использование трипсина для частичного переваривания образцов тканей.
- Культивирование диссекированных тканей в специфических условиях среды.
- Оценка роста клеток и их характеристика с помощью микроскопии и проточной цитометрии.
Основные результаты
- Высокая эффективность колониеобразования наблюдалась в клетках желе Wharton's и соединительной ткани пуповины и плаценты.
- Все МСК экспрессировали схожие маркеры плюрипотентности с вариациями уровней экспрессии.
- МСК продемонстрировали способность дифференцироваться в несколько линий.
- Данная методика может быть эффективно выполнена за два-три часа.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод выделения высококачественных МСК из перинатальных тканей.
- Понимание свойств МСК из различных источников может расширить возможности их терапевтического применения.
- Рекомендуется дальнейшее изучение ниш стволовых клеток в перинатальных тканях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности и практического применения
Данный протокол позволяет выделять мезенхимальные стромальные клетки (МСК) из различных источников перинатальных тканей, предлагая неинвазивную, этически приемлемую альтернативу МСК, полученным из костного мозга. Сравнение таких анатомических областей, как место соединения пуповины и плаценты (CPJ), желе Wharton's jelly (WJ), оболочка пуповины (CL) и фетальная плацента (FP), позволяет использовать данный метод для валидации мишеней и снижения механистических рисков в рамках разработки средств регенеративной медицины. Более высокая эффективность колониеобразования и экспрессия маркеров плюрипотентности, наблюдаемые в МСК, полученных из CPJ, обеспечивают прогностическую уверенность при применении клеточной терапии, помогая в идентификации перспективных кандидатов и сортировке портфеля разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выделения МСК из различных перинатальных ниш с разной способностью к пролиферации и самообновлению.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет функциональной валидации мультипотентности в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях дифференцировки.
- Научная ценность: повышает уверенность в выборе мишени, идентифицируя CPJ как эффективный источник МСК с более высокой эффективностью формирования колоний и экспрессией маркеров плюрипотентности.
Скрининг и разработка анализа
- Практическая ценность: позволяет подготовить валидированные биологические системы для последующих этапов работы, обеспечивая получение гомогенных адгезивных популяций МСК с определенным профилем поверхностных маркеров (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105).
- Научная ценность: решает вопросы стандартизации и воспроизводимости анализа за счет применения согласованных методов эксплантатного культивирования и получения количественных данных, таких как эффективность образования колоний и показатели проточной цитометрии.
- Практическая ценность: подчеркивает готовность к скринингу и масштабируемость: протокол выполняется за два-три часа, что позволяет проводить надежную оценку соединений в каскадах доклинического скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обсуждаются вопросы релевантности заболевания и согласования трансляционных биомаркеров путем демонстрации способности к трехлинейной дифференцировке, что является ключевым функциональным показателем для доклинической валидации.
- Практическая ценность: Описывается непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации путем предоставления МСК, которые сохраняют адгезивную фибробластоподобную морфологию и экспрессию поверхностных маркеров, сопоставимую с МСК, полученными из костного мозга.
- Научная ценность: Основное внимание уделяется прогностической оценке рисков, демонстрируя, что CPJ-MSCs дифференцируются более эффективно, чем клетки из других источников, что обосновывает решения о дальнейшем продвижении проекта с учетом рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум исследований — от этапа раннего поиска до идентификации соединений-лидеров и доклинических испытаний, обеспечивая проверку гипотез, уточнение сигнальных путей и снижение биологических рисков за счет анатомически дифференцированного выделения МСК.
- Открытия в биологии: объясняется, как данный метод поддерживает проверку гипотез и уточнение путей за счет обеспечения возможности сравнения свойств MSC в эпителии пуповины, желе Вартона, области прикрепления пуповины к плаценте и плодовой части плаценты.
- Скрининг: описываются готовность анализа, воспроизводимость и количественные показатели, такие как эффективность формирования колоний (59 для CL, 80 для WJ, что сопоставимо с BM для CPJ), а также анализ экспрессии маркеров методом проточной цитометрии.
- Аналитика: освещаются такие измерения, как эффективность формирования колоний, соотношение интенсивностей флуоресценции и количественный RTPCR для маркеров плюрипотентности, которые помогают группам исследователей сравнивать условия и оценивать прогностическую значимость.
- Трансляционные исследования: метод связывается с доклинической непрерывностью путем демонстрации дифференцировки MSC в адипогенные, хондрогенные и остеогенные линии, что способствует согласованию биомаркеров и функциональной валидации.
- Корпоративное повторное использование: метод представлен как многократно используемый ресурс, а не как одноразовая техника, что позволяет стандартизировать работу с источниками перинатальных тканей для стабильного обеспечения MSC в программах регенеративной медицины.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышение прогностической достоверности, валидация мишеней, устранение механистической неопределенности за счет анатомически дифференцированного выделения МСК и их функциональной характеристики.
- Практическая ценность: стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость благодаря использованию культуры эксплантатов, определенных параметров дигестии и постоянной плотности посева (1×10⁴ cells/cm²).
- Стратегическая ценность: более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях за счет раннего выявления высокопотенциальных источников МСК, таких как CPJ, на этапе поиска.
- Влияние на портфель: приоритизация и принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков на основе сравнительного анализа эффективности пролиферации, самообновления и дифференцировки различных перинатальных источников МСК.
Особенности реализации
- Необходим научный опыт в области диссекции тканей, стерильного культивирования клеток и проточной цитометрии для анализа маркеров.
- Требования к инструментарию и аналитической инфраструктуре включают фазово-контрастную микроскопию, центрифуги, инкубаторы (37°C, 5% CO₂) и проточные цитометры для оценки CD-маркеров и интенсивности флуоресценции.
- Требования к стандартизации между исследовательскими группами включают единообразие протоколов диссекции тканей, нейтрализацию трипсина и плотность посева для обеспечения воспроизводимости результатов между лабораториями.
- При адаптации метода для различных модельных систем следует корректировать размер эксплантата и время дигестии в зависимости от источника ткани, поскольку сроки разрастания различаются (3–4 дня для CPJ, 7–10 дней для CL/WJ, 11–14 дней для FP).
- Практические ограничения, обусловленные исходным материалом, включают необходимость избегать перекрестного загрязнения между источниками тканей во время диссекции, а также вариабельность эффективности колониеобразования и сроков разрастания в зависимости от анатомической области.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Human Umbilical Cord (UC), Cord-Placenta Junction (CPJ), and Fetal Placenta (FP) Processing and Cell Isolation
6:21
Conclusion
4:29
Results: Colony-Forming Efficiency and Mesenchmyal Stromal Cell (MSC) Marker Expression of Perinatal Tissue-Isolated Cells
