Дифференциальная сканирующая калориметрия - метод оценки термической устойчивости и конформации белка антигена

Общая цель этой процедуры заключается в оценке термической стабильности и структурной конформации белков в промышленных условиях с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Дифференциальная сканирующая калориметрия измеряет молярную теплоемкость образцов в зависимости от температуры и успешно используется для оценки термической стабильности и структурной конформации белков. Эта относительно простая процедура не зависит от спиральности структуры или собственных флуорофоров, как это имеет место при использовании других биофизических методов.

Еще одним преимуществом этого метода является то, что он напрямую измеряет температуру теплового перехода и энергию, необходимую для нарушения взаимодействия, стабилизирующего третичную структуру белков. При использовании в сочетании с увлечением развертыванием, температура термического перехода может служить полезным параметром для мониторинга согласованности производственных процессов для биологических препаратов от партии к партии. Визуальная демонстрация этого метода может служить интерактивной средой для эффективной помощи новым пользователям в выполнении критических шагов.

Для начала включите дифференциальный сканирующий калориметр. Затем подайте азот в систему. Это повысит давление в ячейках для подавления кипения образцов, а также предотвратит образование пузырьков при повышенных температурах.

В зависимости от материала, из которого изготовлен элемент питания, отрегулируйте давление подачи газообразного азота в соответствии с рекомендованным производителем давлением, чтобы не повредить элемент. Убедитесь, что все резервуары с чистящим средством заполнены до необходимого объема. К обязательным чистящим средствам относятся моющее средство для мытья ячейки и вода для очистки ячейки после каждого отбора проб.

Установите температуру отсека для хранения образцов на подходящее значение, предпочтительно пять градусов Цельсия, чтобы сохранить целостность образца до начала эксперимента. Важно уравновесить образец относительно буфера, чтобы гарантировать, что единственным различием между растворами является белок. Поэтому наблюдаемую разницу в теплоемкости можно правильно отнести к белку.

Определите концентрацию белка в образце с помощью подходящего метода определения концентрации белка, такого как метод Лоури. Для инструмента, используемого в данном протоколе, предпочтительным рабочим диапазоном является от 0,5 до одного миллиграмма белка на миллилитр. Диализуйте образец в буфере, который будет использоваться в качестве эталона для эксперимента.

Дегазируйте образец и эталонный буфер в вакууме, чтобы избавиться от микропузырьков, которые могут привести к погрешности объема. Работая в ламинарном проточном шкафу для биоизоляции, используйте микропипетку и стерильные наконечники для загрузки образцов из соответствующего буфера попарно в 96-луночные планшеты. Заполните первые две пары лунок буфером, чтобы выполнить сканирование буфера-буфера, чтобы убедиться в пригодности прибора перед измерением образца.

Заполните последние две пары лунок водой, чтобы провести сканирование воды для очистки ячеек. Затем накройте 96 лунку пластины герметизирующей пленкой. Убедитесь, что лунки правильно герметизированы, прежде чем вынимать пластину из шкафа биобезопасности, чтобы избежать загрязнения пробы.

Наконец, поместите планшет в отсек для хранения образцов в правильной ориентации. С помощью программного обеспечения для сбора данных введите информацию об образце в порядке загрузки пластины. Введите концентрацию белка, если таковая имеется.

В противном случае введите концентрацию в программное обеспечение для анализа перед анализом данных. Выберите опцию, обеспечивающую очистку ячейки моющим средством перед каждым сканированием образца. За очисткой следует несколько этапов промывки водой, чтобы в ячейках не осталось остатков моющего средства.

Установите начальную температуру эксперимента на уровне 20 градусов Цельсия, которая может варьироваться в зависимости от образца. Для известных белков можно использовать заранее определенную начальную температуру, в то время как для неизвестных образцов можно применить более низкую начальную температуру. Затем установите окончательную температуру эксперимента.

Конечная температура также может варьироваться в зависимости от предварительного знания образца. Затем задайте скорость сканирования эксперимента. Рекомендуется сканировать неизвестные образцы с разной скоростью сканирования для оценки кинетики раскрытия.

Настройте программное обеспечение для сбора данных для повторного сканирования образцов для проверки обратимости теплового перехода. Разворачивание белка считается обратимым, если энтальпия, полученная при втором сканировании, составляет не менее 80% от значения энтальпии при первом сканировании. Установите термостат после эксперимента на 10 градусов Цельсия, чтобы сохранить целостность ячейки калориметра.

Перед его выполнением убедитесь, что параметры настройки эксперимента верны. Если все на месте, приступайте к эксперименту. После эксперимента выполните анализ данных, как описано в текстовом протоколе.

Для анализа вычитание базовой линии выполняется вручную. Последовательность на этом этапе имеет решающее значение для получения сопоставимых результатов. Здесь показаны репрезентативные исходные данные экспериментального прогона, включая сканирование буфера и воды.

Анализируемые образцы представляют собой токсины в их естественном и детоксифицированном состояниях. Сканы образцов обрабатываются отдельно для получения значений температуры плавления и энтальпии для каждого образца. Для исходного состояния температура плавления составляет 55,55 градусов по Цельсию, а энтальпия токсина составляет 3,157 умножить на 10 к пятой калории на моль.

И наоборот, температура плавления токсина в его детоксицированном состоянии составляет 81,21 градуса Цельсия, а энтальпия — 3,656 умножить на 10 с точностью до пятой калории на моль. Наложение обработанных данных токсина в его нативном и детоксикационном состояниях показывает, что детоксицированный образец более термически стабилен, чем его нативное состояние в соответствии со значениями температуры плавления. Это также указывает на то, что процесс детоксикации вносит структурные изменения в третичную структуру токсина.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о достаточном запасе моющего средства и воды, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение клетки и шприца, поскольку их прозрачность имеет решающее значение для точных результатов. После просмотра этого видео у вас будет хорошее представление о дифференциальной сканирующей калориметрии как методе оценки термической стабильности и конформации белков. Вы также сможете делать значимые выводы из результирующих тепловых прогонов.

Следуя этой процедуре, можно использовать другие методы, такие как круговой дихроизм, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся изменений вторичных структур во время развертки. Данные, собранные для массива партий одного и того же продукта, были использованы для создания эмпирических исходных данных для изучения влияния изменений в процессах, рецептуре и условиях хранения на конформацию структуры белковых антигенов для производства вакцин