Определение белков-лиганд с использованием дифференциальной сканирующей флуориметрии

Общая цель этой процедуры заключается в оценке константы диссоциации для взаимодействия белкового лиганда. Это достигается путем предварительного приготовления смесей белка с различными концентрациями лиганда вместе с индикаторным красителем. Второй шаг заключается в нагреве этих образцов во время регистрации флуоресценции индикатора для контроля развертывания белка.

Затем кривые разворачивания белка преобразуются в ряд температур плавления. Последним шагом является подгонка этих данных под подходящую модель для оценки константы диссоциации. В конечном счете, дифференциальная сканирующая флуориметрия используется для лучшего понимания взаимодействия белка с его лигандами.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как изотермия, титрование, калориметрия и поверхностный плазменный резонанс, заключается в том, что этот метод может быть завершен в течение нескольких часов с использованием лишь умеренного количества образца в приборе, который уже доступен в большинстве институтов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области химии белков, такие как сродство лигандов к белкам и относительная сила взаимодействий. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что выбор образцов для использования и анализ данных могут быть сложными.

Перед началом этой процедуры приготовьте следующие растворы. Смесь, содержащая реагенты, описанные в настоящей таблице, и запасы представляющего интерес лиганда в максимальной доступной концентрации, а также шесть десятикратных разведений этой концентрации. Если из априорных данных известна приблизительная константа диссоциации, подготовьте по крайней мере две концентрации выше и ниже kd.

Пример таблицы приведен здесь. Внесите по 18 микролитров смеси в каждую из восьми лунок. В планшете A-Q-P-C-R добавьте по два микролитра растворителя в первую лунку в каждую из оставшихся семи лунок, добавьте по два микролитра каждого члена ряда разведения лиганда.

Поместите уплотнение A-Q-P-C-R на пластину, чтобы добиться хорошего уплотнения пластины. Поместите ручной аппликатор в середину пластины, разгладьте уплотнение с одной стороны, а затем повторите на другой половине пластины. Центрифугируйте пластину при 500 умноженных на G в течение двух минут, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Затем поместите планшет в прибор QPCR с первым шагом. Выберите опцию кривой расплавления, фильтры пород, и выберите быструю скорость нарастания. Запустите термическую денатурацию по завершении работы прибора.

Нажмите на кнопку анализа на экране. Сохраните файл с результатом. Откройте программное обеспечение для теплового сдвига белка.

Создайте новое исследование на вкладке свойств. Присвойте ему имя, а на вкладке условий подробно опишите лиганды. Перейдите на вкладку файлов эксперимента и импортируйте сохраненный файл результатов.

Задайте содержимое каждого из них. Что ж, перейдите на вкладку анализа и нажмите кнопку анализа, чтобы проанализировать результаты. Убедитесь, что белок в присутствии одного растворителя дает результат, аналогичный показанному на этом рисунке.

Затем изучите температуру плавления, наблюдаемую в результатах повторной боли. Убедитесь, что при этом наблюдается явное увеличение температуры плавления с увеличением концентрации лиганда. Эти данные будут использованы для получения приблизительного значения константы диссоциации, как описано в сопроводительном документе.

Эти растворы необходимы для проведения процедуры определения константы диссоциации, мастер-смеси, как подробно описано в данной таблице, и запасов лиганда при 15 различных концентрациях, которые будут разбавлены в десять раз. В финальном эксперименте. В идеале следует включать концентрации лигандов, по меньшей мере на два порядка выше и ниже расчетного kd, и центрировать концентрации на расчетном kd.

Здесь приведен пример ряда разрежений. Сосредоточьтесь на семи точках в пределах порядка величины расчетной KD и еще на четырех точках по обе стороны от нее. Если есть выбор, включите больше точек на значения, которые насыщают.

Добавьте 120 микролитров исходной смеси в каждую из восьми лунок в 96-луночной пластине с U-образным дном, которая будет действовать как резервуар для удобного дозирования мастер-смеси. Затем с помощью восьмиканальной пипетки дозируйте 18 микролитров мастер-смеси в одну колонку ПЦР-планшета. Повторите для следующих пяти столбцов, чтобы получить в общей сложности 48 заполненных лунок в формате шесть на восемь на пластине.

Далее добавьте по 20 микролитров стеблей лиганда или растворителя в каждую из восьми лунок. В другом 96-луночном планшете с U-образным дном с помощью восьмиканальной пипетки отасканируйте два микролитра восьми различных лигандов или растворителей и добавьте их в одну колонку ПЦР-планшета, который был заполнен основной смесью. Повторите то же самое с теми же восемью лигандами или запасами растворителя.

Для двух последующих колонок отаскайте два микролитра из оставшихся восьми запасов лиганда или растворителя и добавьте их в четвертую колонку в планшете. Повторите это для следующих двух столбцов. Это позволит получить тройные образцы для всех 16 образцов лиганда и растворителя.

Поместите пломбу A-Q-P-C-R на пластину. Центрифугируйте планшет при 500-кратном G в течение двух минут. Поместите планшет в прибор QPCR и запустите термическую денатурацию с использованием параметров, указанных ранее в конце работы прибора.

Нажмите на кнопку анализа на экране. Сохраните файл с результатом. Откройте программное обеспечение для теплового сдвига белка.

Создайте новое исследование на вкладке свойств. Дайте ему имя, а на вкладке условий подробно опишите лиганды. Перейдите на вкладку файлов экспериментов, импортируйте сохраненный файл результатов и задайте содержимое каждого из них.

Ну и переходим на вкладку анализа и нажимаем кнопку анализа. Выберите вкладку «Репликации» в меню в левой части экрана, чтобы отобразить результаты. В тройном составе.

Оцените надежность данных на основе того, насколько плотны тройки. Должны ли тройки демонстрировать плохую воспроизводимость. Внимательно изучите исходные данные.

Анализируйте данные с помощью метода boltman или производных. Чтобы оценить температуру плавления, выберите вкладку «Результаты репликации» и на графике результатов репликации переключите график «По» между tm, Boltzmann и производной TM. Выберите метод, обеспечивающий большую воспроизводимость образца.

Для образцов, которые показывают множественные переходы, почти всегда лучше использовать метод производных в режиме множественного плавления. Экспортируйте результаты для дальнейшего изучения в Excel с помощью вкладки экспорта. Начните этот анализ с создания таблицы в Excel концентраций лигандов и температуры плавления.

Откройте программное обеспечение для работы с призматическими диаграммами GraphPad и создайте таблицу XY. Введите данные с помощью столбца X для концентраций лиганда и столбца Y для результатов температуры плавления. На вкладке анализа выберите опцию аппроксимации кривой нелинейной регрессии.

Чтобы ввести правильную модель, выберите новую и создайте новое уравнение. Вставьте соответствующее уравнение в качестве связывания лиганда с одним сайтом. Выберите поле Правила для начальных значений и введите правила для начальных значений.

Ограничьте параметр P как постоянный, равный для ввода конечной концентрации белка. Выберите «Анализ» для выполнения анализа, «Дополнительный анализ» для подгонки данных к модели совместной работы или «Подгонка данных под кривые». Отображение двоичных сдвигов температуры плавления описано в сопроводительном тексте протокола.

Этот метод был использован для измерения взаимодействия гексокиназы с глюкозой. Первоначальный скрининг предполагает вероятную БК от 0,2 до 1,7 миллимолара. Результаты более крупного экрана показывают хорошее соответствие модели для одного события связывания с KD 1,2 плюс-минус 0,1 миллимоляра, предполагаемая трансфераза HETO SQUA L WCBM показывает сильный тепловой сдвиг при связывании с GTP.

Первоначальный скрининг показал KD от 200 до 500 микромоляров. Детальный эксперимент показывает, что кажущееся KD составляет 120 плюс-минус 20 микромоляров. Однако, когда для оси X используется логарифмическая шкала, существует значительное расхождение между моделью и анализом данных, анализ тех же данных с кооперативной моделью показывает отличное соответствие данным, подразумевая, что WCBM антикооперативен в своей привязке к GTPA. Довольно необычный результат наблюдается при предполагаемом GDP 60, oxy Beta D mano, Heur two oh, ACE WCBI.

Без лиганда и при высоких концентрациях лигандов наблюдается простая монофазная картина плавления. Однако при промежуточных концентрациях лигандов наблюдаются два отчетливых пика плавления. Переход между двумя наборами пиков зависит от дозы во всем диапазоне концентраций, моделируя двухфазное плавление.

Как сумма пропорций лиганда, результаты свободного и высокого лиганда дают хорошее соответствие данным. Эта посадка улучшается за счет экстраполяции результата, наблюдаемого при высокой концентрации лиганда, на полную заполняемость. Полученные данные о доле WCBI, связанного с лигандом, отлично подходят для простой модели связывания.

При KD 58 плюс-минус два микромоляра После освоения эта техника может быть выполнена за четыре или пять часов, включая повторы, если она выполнена правильно После этой процедуры. Другие методы, такие как флуоресценция вен на вершине вен и калориметрия изотермического титрования, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как температурная зависимость и геометрия STA. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как определить оценку константы диссоциации взаимодействия с помощью дифференциального сканирования гриппа.