Инкапсуляция клеток млекопитающих в альгинатных шариках с использованием простого перемешиваемого сосуда

В этом видео описывается метод иммобилизации клеток млекопитающих, таких как островки поджелудочной железы в альгинатных шариках, с помощью простого перемешанного сосуда. Принцип метода заключается в получении альгинатных капель с помощью воды и масляной эмульсии с последующим внутренним гелеобразованием альгинатных капель. Первым этапом процедуры является создание эмульсии, в которой водная фаза, содержащая альгинатные клетки и карбонат кальция, диспергируется в минеральном масле, органической фазе.

Второй шаг заключается в подкислении эмульсии путем добавления маслорастворимой кислоты, такой как уксусная кислота, которая быстро разделяется на водную фазу. Падение pH приводит к растворению карбоната кальция и к внутреннему гелеобразованию альгинатных капель в гранулы. Заключительный этап состоит в извлечении шариков из эмульсии путем добавления водного раствора, разделении фаз центрифугированием с последующей промывкой и фильтрацией шариков.

Затем иммобилизованные клетки могут быть культивированы in vitro или использованы для трансплантации. Описанный нами метод является альтернативой использованию инкапсуляторов ячеек на основе сопел для получения альгинатных шариков. Это было получено в результате метода иммобилизации ферментов и микробных клеток, впервые описанного Понселе и другими в 1992 году.

Применение, которое нас интересует больше всего, — это альгинатная инкапсуляция в качестве средства иммуноизоляции трансплантированных клеток, чтобы уменьшить или даже устранить необходимость в препаратах против отторжения. Основными преимуществами эмульсионного процесса по сравнению с сопловыми устройствами являются его масштабируемость и надежность. Поскольку капли образуются почти одновременно, очень большое количество гранул может быть получено за очень короткие промежутки времени либо из очень разбавленных, либо из очень концентрированных растворов альгината.

Более того, процесс очень надежен и не подвержен сбоям, и даже при наличии частиц, которые могут препятствовать соплам, и, наконец, технологическое оборудование достаточно простое и поэтому доступное, очень относительно недорогое для большинства лабораторий. Ключевыми этапами обработки являются эмульгирование с образованием альгинатных капель и подкисление для высвобождения внутреннего источника кальция. Размер капель зависит в первую очередь от конструкции рабочего колеса, скорости перемешивания и продолжительности перемешивания.

Механические свойства гранул и выживаемость клеток зависят от степени и продолжительности закисления. В этом видео мы демонстрируем метод, используемый для инкапсуляции клеток в 5%-ные альгинатные гранулы для трансплантации. Эти параметры, вероятно, потребуют оптимизации для других потенциальных применений.

Чтобы получить 5%-ные альгинатные шарики, содержащие смесь альгинатов LVM и MVG, взвесьте 583 мг LVM и 583 мг порошка альгиновой кислоты MVG. Поместите 20 миллилитровый технологический буфер на магнитную пластину для перемешивания. Для трансплантации мы используем 10 миллимолярный буфер HEPES, содержащий 170 миллимоляров хлорида натрия с pH 7,4.

Постепенно добавляйте в раствор порошок альгиновой кислоты. Оставьте раствор помешивать на ночь на низкой скорости. При необходимости закрепите колбу на пластине для перемешивания.

На следующий день, если альгинат растворился не полностью, закрепите банку на роторном миксере и продолжайте перемешивание в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Как только альгинат полностью растворится, простерилизуйте раствор путем автоклавирования в течение 30 минут. Дайте температуре упасть ниже 50 градусов по Цельсию перед открытием автоклава.

Приготовьте суспензию карбоната кальция, добавив один грамм карбоната кальция в 20 миллилитров технологического буфера. Автоклав суспензии карбоната кальция и емкость с перемешиванием используются для процесса эмульсии. Перед использованием удалите все следы конденсированной воды из емкости.

Непосредственно перед процессом эмульсии растворите 44 микролитра ледяной уксусной кислоты в 11 миллилитрах минерального масла, помещенного в 50-миллилитровую коническую трубку. Распространенной ошибкой является неполное растворение уксусной кислоты, избегайте пипетирования в количествах менее 10 микролитров и следите за тем, чтобы кислота полностью растворилась путем многократного завивания. Дайте всем растворам нагреться до комнатной температуры, прежде чем приступать к инкапсуляции ячеек.

Налейте 10 миллилитров минерального масла в колбу и начните помешивать при 250 оборотах в минуту. Если используются адгезивные клетки, такие как бета-tc3-клетки, трипсинизируйте клетки. Завершите реакцию добавлением полной среды и возьмите образец для перебора клеток.

Определяйте концентрацию клеток вручную или с помощью автоматического счетчика клеток. Центрифугируйте клетки в течение семи минут при 300 g, а затем повторно суспендируйте поддон клеток в полной среде. Повторите этап центрифугирования, а затем повторно суспендируйте клетки в соответствующем объеме готовой среды для получения в 10 и 1/2 раз большей желаемой конечной концентрации в гранулах.

Перелейте 9,9 миллилитра раствора альгината в пробирку с плоским дном, затем добавьте 1,1 миллилитра клеточного запаса и 550 микролитров суспензии карбоната кальция. Смешайте альгинат, карбонат кальция и клеточную суспензию путем легкого вортексинга. Сразу же перелейте 10,5 миллилитра этой смеси в масло для перемешивания с помощью шприца.

Увеличьте скорость перемешивания, а затем запустите таймер. Чтобы определить скорость перемешивания, сначала необходимо построить стандартную кривую, связывающую размер валика со скоростью перемешивания. Через 12 минут добавьте 10 миллилитров масла и раствор уксусной кислоты, чтобы подкислить эмульсию, освободить кальций от карбоната и получить гелеобразные шарики.

Подождите восемь минут для этого этапа внутреннего гелеобразования. Обратите внимание на изменение цвета эмульгированных капель, которые содержат фенольный красный индикатор pH. Уменьшите скорость перемешивания до 400 об/мин, нейтрализуйте кислоту, добавив 40 миллилитров технологического буфера, смешанного с 10%-ной средой, что приводит к инверсии фаз.

Через минуту прекратите перемешивание и переложите смесь в конические трубки. Промойте колбу спиннера еще 20 миллилитрами среды, и добавьте это в трубочки. Отбирайте как можно больше водного раствора перед откачкой масляной фазы.

Центрифугируйте пробирки в течение трех минут при 630 g для ускорения осаждения гранул и разделения фаз. Удалите масло и излишки технологического буфера путем аспирации с помощью пастеровской пипетки. Промыть бусины не менее одного раза средой с помощью центрифугирования 630 г между стирками.

Отфильтруйте суспензию шариков на 40-микронных нейлоновых ячеистых фильтрах и отоберите лишнюю жидкость из фильтра снизу. Перенесите бусины в известный объем среды с помощью шпателя. Измерьте объем шариков и долейте среду для получения желаемой концентрации шариков.

Типичная концентрация составляет один миллилитр шариков на пять миллилитров общего объема. С этого момента всегда обращайтесь с шариками с помощью пипеток большого диаметра, чтобы не повредить бусины. Инкапсулированные клетки теперь могут быть перенесены в Т-колбы и использованы для культивирования in vitro или трансплантации.

По окончании процесса эмульсии должны быть получены альгинатные шарики, содержащие иммобилизованные клетки. После этого процесса следует регулярно оценивать распределение гранул по размерам и выживаемость клеток. Чтобы определить распределение бусин по размерам, бусины могут быть окрашены толуидиновым синим с последующим анализом изображения.

От этого процесса ожидается широкое распределение гранул по размерам. Для оценки выживаемости клеток гранулы можно инкубировать с живыми мертвыми красителями, такими как кальцеин-АМ и гомодимер этидия. С помощью процесса, описанного в этом видео, была измерена выживаемость 76% бета-tc3-клеток.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как обездвижить клетки млекопитающих в альгинатных бусинах с помощью простой перемешиваемой системы. Базовый протокол, показанный в этом видео, должен подходить для иммобилизации различных типов клеток с использованием широкого спектра альгинатных типов и кальцитраций. Мы рекомендуем строить стандартную кривую, связывающую средний размер валика со скоростью перемешивания с каждой новой партией альгината или масла.

Процесс эмульгирования, который мы описали, является многообещающей альтернативой инкапсуляторам ячеек на основе сопел. Это надежный и простой метод иммобилизации клеток млекопитающих в альгинатных бусинах. По мере того, как мы и другие люди во всем мире развиваем терапию соплевыми клетками, такой масштаб методов потребуется для многих тысяч пациентов с диабетом.

Мы опубликовали многообещающие результаты трансплантации линии бета-клеток в 5%-ные альгинатные гранулы и продолжаем исследовать in vivo эффективность этого улучшенного барьера для отторжения трансплантата.