Сотовая Инкапсуляция в 3D гидрогелей для тканевой инженерии

Поэтапный процесс инкапсуляции клеток начинается с подготовки и стерилизации форм для гидрогеля и других материалов, после чего следует изоляция клеток в отдельные популяции в пробирки для каждого набора гелей. Затем проводится полимеризация в присутствии клеток, после чего следует период инкубации in vitro или in vivo. Последующий анализ поведения клеток может включать тесты на жизнеспособность, морфологию, пролиферацию и дифференцировку.

Здравствуйте, я Амидио Кахан из лаборатории доктора Джейсона Бёрдика кафедры биоинженерии Пенсильванского университета. Сегодня мы продемонстрируем процедуру инкапсуляции клеток в трехмерные гидрогели для тканевой инженерии. Мы используем этот метод для изучения влияния состава и структуры гидрогеля на поведение инкапсулированных клеток.

Итак, приступим. Для начала данной процедуры приготовьте 0,5% вес/объем раствор фотоинициатора Irgacure 2959 в PBS. Перемешайте и инкубируйте в течение двух-трех дней в темноте при 37 °C.

Когда раствор будет готов, профильтруйте его через шприцевой фильтр для стерилизации и храните при комнатной температуре. Затем с помощью программы для работы с электронными таблицами, например Microsoft Excel, рассчитайте необходимое количество полимера и сшивающего агента, как показано в примере. Здесь представлена гиалуроновая кислота, функционализированная акрилатными реакционноспособными группами.

Также рассчитайте количество пентапептида, содержащего функциональный адгезивный домен с аминокислотами цистеином, аргинином, глицином и аспартатом. Цистеин необходим для прикрепления к полимеру. После определения требуемого количества полимерного сшивающего агента и пептида, отвезнего их и поместите каждый компонент в отдельную пробирку типа «эппендорф».

Соответственно скорректируйте расчетную таблицу. Для определения фактической массы полученного полимера перейдите к разделу «Приготовление форм для геля». Используя лезвие бритвы, отсеките кончики индивидуально упакованных стерильных

Одноразовые шприцы объемом один миллилитр. Убедитесь, что срез выполнен ровно, чтобы формы могли использоваться для переноса фотопаттернов на гели. В завершение простерилизуйте формы из шприцев, трубки EOR с открытыми колпачками и другие необходимые материалы, поместив их под бактерицидную лампу, встроенную в бокс биологической безопасности, на 30 минут.

После завершения стерилизации приступайте к подготовке клеток, предварительно простерилизовав экспериментальное оборудование. Работая в вытяжном шкафу, добавьте стерильный TEA к полимеру, используемому для сшивки микального типа, и стерильный PBS к полимеру, используемому для радикальной сшивки. Добавьте соответствующий буфер в пробирки с подвесными фрагментами и перемешайте на вортексе.

Для растворения подвешенной части, которая связывается с алкилированной гиалуроновой кислотой через тиольную группу INE-фрагмента пептида для присоединения подвешенной части к полимеру, добавьте ее в раствор полимера и герметично закройте параметром. Кратко: перемешайте на вортексе и инкубируйте при 37 °C с перемешиванием. Пока происходит присоединение подвешенной части, подготовьте клетки для инкапсуляции, например, мезенхимальные стволовые клетки человека или HMCs, промыв их PBS.

Затем инкубируйте с трипсином в течение одной минуты при комнатной температуре, удалите трипсин и инкубируйте еще пять минут при 37 °C. Затем добавьте среду для роста HMSC, чтобы нейтрализовать трипсин и отделить клетки от поверхности планшета. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.

Разделите подсчитанные клетки на порции, содержащие необходимое количество для каждого набора гелей. Для набора из трех гелей по 50 µL при плотности 10 миллионов клеток на мл отделите 1,5 миллиона клеток в отдельную коническую пробирку. Не готовьте более четырех гелей в одном наборе из-за ограничений по времени проведения процедуры.

Затем центрифугируйте клетки при 500 RCF в течение шести минут. Пока клетки осаждаются, при комнатной температуре приготовьте полимеризационную смесь для сшивания микальной версии. Добавьте буфер к сшивающему агенту для достижения необходимой концентрации.

Для инициации свободнорадикального сшивания светом добавьте ранее приготовленный раствор I 2 9 5 9 к раствору полимера. Добавьте его в объеме 10% от общего объема формируемого геля, чтобы конечная концентрация инициатора составила 0,05% по массе. Теперь клетки и смесь для полимеризации готовы к инкапсуляции в гидрогель.

Начните с аспирации супернатанта из центрифугированных клеток. Дождитесь оседания жидкости после первой аспирации и повторите процедуру, чтобы удалить максимально возможный объем среды, не повреждая осадок клеток. Ресуспендируйте осадок клеток с помощью полимерного раствора, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.

Медленно перемешивайте раствор пипеткой, поднимая и опуская ее примерно 10 раз, что должно обеспечить равномерное распределение клеток. Для реакции присоединения микромасштабного типа используйте наконечник пипетки с широким отверстием, чтобы добавить соответствующий объем раствора сшивающего агента в полимерную ячейку. Перемешайте. Установите на пипетке необходимый объем для одного геля.

Перемешивайте раствор пипеткой путем многократного всасывания и вытеснения для гомогенизации, затем распределите его по формам для наконечников шприцев. Выполняйте этот шаг быстро, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, и выдержите пробу в течение 10–30 минут в стерильном боксе для сшивания. Для инициации светового свободнорадикального сшивания.

Располируйте соответствующий объем в формы для наконечников шприцев. Подвергните шприцы воздействию УФ-излучения с длиной волны 365 нанометров в течение 10 минут для радикальной сшивки. Для полимеров, функционализированных ACRL, обычно используется УФ-излучение с интенсивностью 4 милливатта на квадратный сантиметр.

Выполняйте этот этап быстро, чтобы минимизировать осаждение клеток перед воздействием УФ-излучения. После сшивания погрузите гели в лунки планшета для культивирования тканей, содержащие среду для инкубации и анализа. Сшивание гидрогеля также может быть выполнено последовательно.

Сначала добавьте функционализированный краситель метолированный румин до конечной концентрации 20 nanomolar в геле. Краситель помогает визуализировать структуру, так как он преимущественно встраивается в радикально сшитые области геля. Затем начните реакцию полимеризации с использованием микротипа, которая обеспечивает долю теоретических сшивок для последующих этапов.

Для сшивания путем свободнорадикальной полимеризации необходимо использовать маску, созданную в такой программе, как Adobe Photoshop или Illustrator, и распечатанную непосредственно на прозрачных пленках. Размеры маски должны соответствовать круглому верхнему краю шприца. С помощью стерильного пинцета нанесите стерильную маску непосредственно на поверхность геля и подвергните воздействию света для сшивания геля.

Далее представлены HMC в гидрогелях на основе HA через один час после инкапсуляции. Поскольку синтезированные гидрогели обычно прозрачны, морфологию клеток можно визуализировать с помощью световой микроскопии. Те же клетки были исследованы на жизнеспособность через 24 часа после инкапсуляции с использованием набора для флуоресцентного окрашивания живых и мертвых клеток.

Для детекции живых клеток мы использовали calcium M, а для погибших — atherium homodimer, при этом жизнеспособность составила более 95%. Мы также использовали тест Alamar Blue для определения уровня пролиферации клеток, который измеряли по интенсивности метаболизма реагента, приводящего к изменению цвета. Окрашивание клеток проводили на H HMCs через семь дней после инкапсуляции в биодеградируемом адгезивном гидрогеле на основе HA с использованием стандартных процедур фиксации и пермеабилизации.

Клеточный актин визуализируют с помощью флуоресцеиново-меченого фаллоидина, а ядра фиксируют с помощью DPI. Для визуализации фокальных адгезий внутри матрицы гидрогеля используется иммуноокрашивание на куллин. Гистологическое окрашивание проводится после дегидратации, заливки в парафин и нарезки срезов гидрогелей по стандартным протоколам для радикально полимеризованных гидрогелей на основе ГА с инкапсулированными HMSC.

После одной недели культивирования образцы окрашивали гематоксилином для маркировки ядер, анилиновым синим для соединительной ткани и синими красителями для гликозаминогликанов. ПЦР в реальном времени используется для количественной оценки дифференцировки инкапсулированных стволовых клеток. После вычитания фонового сигнала уровень экспрессии интересующего гена определяется по количеству циклов, при котором достигается пороговое значение флуоресценции, по сравнению с пассивным референсным сигналом — конститутивно активным геном «домашнего хозяйства». Таким образом, мы продемонстрировали способ инкапсуляции клеток в 3D-гидрогели и изучения поведения клеток в гелях.

При использовании данных процедур важно обеспечить полную стерильность материалов, либо за счет длительного хранения стерильных буферных растворов и реагентов, либо путем стерилизации с помощью бактерицидной УФ-лампы. На этом всё. Благодарим за внимание и желаем удачи в ваших экспериментах.