Сотовая Инкапсуляция в 3D гидрогелей для тканевой инженерии

Поэтапный процесс инкапсуляции клеток начинается с подготовки и стерилизации гидрогелевых форм и других материалов, за которыми следует выделение клеток в отдельные популяции, в пробирки для каждого гелевого набора. Затем проводится инкубация в присутствии клеток, за которой следует инкубационный период in vitro или in vivo. Последующий анализ поведения клеток может включать тесты на жизнеспособность, морфологию, пролиферацию и дифференцировку.

Привет, Амидио Кахан из лаборатории доктора Джейсона Бердика на факультете биоинженерии Университета Пенсильвании. Сегодня мы покажем вам процедуру инкапсуляции клеток в 3D гидрогелях для тканевой инженерии. Мы используем эту процедуру для изучения влияния состава и структуры гидрогеля на поведение инкапсулированных клеток.

Итак, приступим. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте 0,5%-ный массовый раствор фотоинициатора Air cure 2 9 5 9 или I 2 9 5 9 в PBS. Перемешайте и выдержите два-три дня в темноте при температуре 37 градусов Цельсия.

Когда все будет готово, используйте шприц-фильтр для стерилизации раствора и храните его при комнатной температуре. Затем используйте программу для работы с электронными таблицами, такую как Microsoft Excel, чтобы рассчитать необходимое количество полимера и сшивающего агента. Здесь представлена гиалуроновая кислота, функционализированная акрилатными реактивными группами.

Также рассчитайте количество пенантного пептида, содержащего функциональный адгезивный домен с аминокислотой цистином, аргинином, глицином и аспартатом. Цистин предназначен для привязки к полимеру. Теперь, когда определены необходимые количества полимерного сшивающего агента и пента, взвесьте их и поместите каждый в пробирку эйнора.

Соответствующим образом скорректируйте таблицу расчетов. По фактической массе полученного полимера приступаем к подготовке гелевых форм. С помощью лезвия бритвы отрежьте кончики индивидуально упакованных стерильных материалов.

Одноразовые шприцы на один миллилитровый. Убедитесь, что сделан плоский срез для форм, которые будут использоваться для фоторисунка и гелей. Наконец, простерилизуйте шприцевые формы, трубки для повышения нефтеотдачи с открытыми крышками и любые другие необходимые материалы, поместив их под бактерицидный источник света, встроенный в шкаф биологической безопасности, на 30 минут.

После завершения стерилизации приступайте к подготовке клеток после стерилизации экспериментального оборудования. Поработайте в колпаке и добавьте стерильный TEA к полимеру, используемому в сшивании мышечного типа, и стерильный PBS к полимеру, используемому для сшивания свободных радикалов. Добавьте соответствующий буфер к подвесным групповым трубкам и вихревым трубкам.

Чтобы растворить кулонную группу, связывается с алкилированной гиалуроновой кислотой через тиол из группы INE на пептиде, чтобы прикрепить кулонную группу к полимеру, добавьте его в полимерный раствор и запечатайте параметром. Коротко вортексить и инкубировать при 37 градусах Цельсия с перемешиванием. Во время подготовки клеток, пока прикреплена подвесная группа, подготовьте клетки к инкапсуляции tryis, человеческих мезенхимальных стволовых клеток или HMC, промыв их PBS.

Затем инкубировать с трипсином в течение одной минуты при комнатной температуре, удалить трипсин, инкубировать еще пять минут при 37 градусах. Затем добавьте питательную среду HMSC, чтобы нейтрализовать трипсин и освободить клетки от поверхности пластины. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

Разделите подсчитанные ячейки на порции, содержащие соответствующее количество для каждого набора гелей. Для набора из трех гелей по 50 микролитров с плотностью 10 миллионов клеток на миллилитр разделите 1,5 миллиона клеток в отдельную коническую трубку. Не готовьте более четырех гелей в индивидуальном наборе из-за времени приготовления.

Затем центрифугируйте ячейки при 500 RCF в течение шести минут. При комнатной температуре, пока ячейки вращаются, приготовьте полимеризационную смесь для сшивания мышечного издания. Добавьте буфер в сшивающий агент для достижения соответствующей концентрации.

Для инициированного светом сшивания свободных радикалов добавьте в раствор полимера заранее приготовленный раствор I 2 9 5 9. При 10% от общего объема геля-фиксатора для конечного инициатора концентрация 0,05% от массы. Теперь ячейки и полимеризационная смесь готовы к инкапсуляции в гидрогель.

Начните с аспирации сnat из ячеек центрифуги. Подождите, пока жидкость осядет после первоначальной аспирации, и повторите аспирацию, чтобы удалить как можно больше среды, не нарушая клеточную гранулу Resus. Суспензируйте клеточную гранулу с полимерным раствором, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.

Медленно пипетируйте раствор вверх и вниз около 10 раз, что должно быть достаточно для равномерного распределения клеток. Для реакции присоединения мышечного типа используйте наконечник пипетки с широким отверстием, чтобы добавить соответствующий объем раствора сшивающего агента в полимерную ячейку. Перемешайте. Установите пипетку на нужный индивидуальный объем геля.

Пипеткой нагнетайте раствор вверх и вниз до гомогенизации и Eloqua в формы с наконечниками шприца. Выполните этот шаг быстро, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, и дайте 10-30 минут инкубации в культуральном колпаке для сшивания. Для света инициируется сшивание свободных радикалов.

Разложите соответствующий объем по формочкам с наконечником шприца. Подвергайте шприцы воздействию ультрафиолетового излучения для радикального сшивания при воздействии на 365 нанометров в течение 10 минут. Ультрафиолетовое излучение мощностью четыре милливатта на квадратный сантиметр является обычным явлением для функционализированных полимеров ACRL.

Выполняйте этот шаг быстро, чтобы свести к минимуму оседание клеток перед воздействием ультрафиолетового света. После сшивания гели погружают в лунки планшета для культуры тканей, содержащего среды, для инкубации и анализа. Сшивание гидрогеля также может быть выполнено последовательно.

Во-первых, добавьте функционализированный краситель метола рубца до конечной концентрации 20 наномоляров в геле. Краситель помогает визуализировать узор, поскольку он преимущественно встраивается в радикально сшитые участки геля. Затем начните с реакции полимеризации типа mic, в результате которой будет получена доля теоретических сшивок для следующих этапов.

Для сшивания свободных радикалов потребуется использовать маску, разработанную в программе, такой как Adobe Photoshop или Illustrator, и напечатанную непосредственно на прозрачных масках. Размеры маски должны совпадать с верхней частью круглого шприца. С помощью стерилизованного пинцета нанесите стерильную маску непосредственно на поверхность геля и под воздействием света сшите гель.

Далее здесь показаны ТМП в гидрогелях на основе ГК через час после инкапсуляции. Поскольку синтезированные гидрогели обычно прозрачны, клетки могут быть визуализированы на морфологию с помощью световой микроскопии. Те же клетки визуализировали на жизнеспособность через 24 часа после инкапсуляции с помощью флуоресцентного набора для окрашивания живых мертвецов.

Мы использовали кальций М для обнаружения живых клеток и гомодимер атерия для мертвых клеток и наблюдали жизнеспособность более 95%. Мы также использовали анализ аламарского синего для определения уровня пролиферации клеток, измеряемого тем, насколько хорошо клетки метаболизируют реагент анализа, что приводит к изменению цвета. Окрашивание клеток проводили на H-HMC через семь дней после инкапсуляции в разлагаемый и адгезивный гидрогель на основе ГК с использованием стандартных процедур фиксации и проницаемости.

Клеточный актон виден с помощью меченного флуоресцеином пина пина и ядер, ограниченных dpi. Иммуноокрашивание против каллина используется для визуализации очаговых спаек в гидрогелевой матрице. Гистологическое окрашивание проводится после обезвоживания, заделки парафина и срезов гидрогелей с использованием стандартных протоколов радикально полимеризованных гидрогелей, инкапсулированных HMSC HA.

После одной недели в культуре окрашивали гематтоином, маркирующим ядра, и ASIN, обозначающим соединительную ткань А, и синим красителем для гликозаминогликанов. В реальном времени. ПЦР используется для количественной оценки дифференцировки инкапсулированных стволовых клеток После вычитания фона уровень экспрессии интересующего гена определяется номером цикла, в котором была достигнута пороговая флуоресценция по сравнению с пассивным референсным сигналом, который является конститутивно активным геном хозяйству. Итак, мы только что показали вам, как инкапсулировать клетки в 3D-гидрогели и изучить поведение клеток в гелях.

При использовании этих процедур важно обеспечить полную стерильность материалов, либо путем длительного хранения стерильных буферных растворов и реагентов, либо путем стерилизации с помощью бактерицидной УФ-лампы. Вот и все. Спасибо за умывание и удачи в ваших экспериментах.