Простой фракционированный метод экстракции для комплексного анализа метаболитов, липидов и белков из одного образца

Общая цель этого метода заключается в восстановлении и анализе всех основных молекулярных соединений, включая полярные и полуполярные метаболиты, липиды и белки, из одного образца с использованием простой фракционированной экстракции метилтрибутиловым эфиром. Как правило, ученым трудно анализировать несколько классов соединений из одного образца. Используя экстракцию МТБЭ, которую мы представляем здесь, вы можете извлекать и анализировать несколько классов соединений, таких как липиды, метаболиты и белки, из одного образца.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может надежно извлекать все классы молекулярных соединений из небольшого количества аликвоты в одном образце. Этот метод помогает ответить на фундаментальные вопросы системной биологии, поскольку он обеспечивает экспериментальную основу для мультиомного анализа, предоставляя дроби, которые могут быть использованы для анализа с помощью протеомики, липидомики и метаболомики. Следующий протокол продемонстрирован на примере ткани листьев арабидопсиса.

Arabidopsis — это небольшие цветущие растения семейства Brassicaceae, родственные капусте. Начните эту процедуру с предварительного охлаждения держателей трубок тканевого гомогенизатора в жидком азоте в течение не менее 10 минут. Извлеките образцы из жидкого азота и поместите их в держатели пробирок.

А затем снять держатели пробирок с жидкого азота. Быстро поместите держатели пробирок в гомогенизатор тканей и установите гомогенизатор на измельчение биологического материала в мелкий и однородный порошок. Для листьев используйте 20 герц в течение одной минуты.

Время и скорость гомогенизации могут варьироваться в зависимости от ткани. Убедитесь, что вы гомогенизируете до тех пор, пока полученный образец не превратится в очень мелкий порошок. При этом образец должен храниться в замороженном виде на каждом этапе гомогенизации.

Гомогенизируйте образцы, затем извлеките биологические образцы из держателей пробирок. А если они не будут использоваться сразу, поместите их в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов по Цельсию до дальнейшего отжима. Наклейте на четыре двухмиллилитровые микроцентрифужные пробирки с круглым дном с безопасным замком и номером образца.

Предварительно охладите трубки и некоторые шпатели, погрузив их в жидкий азот. Как только пробирки и шпатели остынут, поместите одну из пробирок на аналитические весы и с помощью шпателя насыпьте 25 миллиграммов тканевого порошка в микроцентрифужную пробирку. Запишите точный вес каждого образца, затем немедленно поместите соответствующие образцы в жидкий азот.

Выполняйте этот шаг быстро, чтобы избежать размораживания растительного материала. Храните аликвотированные образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшей экстракции. Для подготовки к экстракции необходимо предварительно охладить метил-трет-бутиловый эфир, или смесь для экстракции метанола МТБЭ, приготовленную, как описано в сопроводительном документе, в морозильной камере при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Выньте аликвотированные образцы и добавьте по одному миллилитру предварительно охлажденной экстракционной смеси в каждую пробирку с образцом. Выполните этот шаг быстро. МТБЭ имеет низкую вязкость и может капать из наконечника пипетки.

Немедленно перемешайте каждый образец на вихревом смесителе до тех пор, пока ткань не станет хорошо гомогенизированной в экстракционной смеси. Держите пробирки в штативе на столе до тех пор, пока не будут извлечены все образцы. Этот шаг имеет решающее значение.

Здесь мы осаждаем белки и инактивируем их ферментативную активность. Инкубируйте все образцы на орбитальном вибростенде со скоростью 100 об/мин в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия. Затем обрабатывайте образцы ультразвуком в течение 15 минут в ледяной ультразвуковой ванне.

Затем для фракционирования путем разделения фаз добавьте 650 микролитров раствора воды и метанола в соотношении три к одному в каждую пробирку с образцом. Затем перемешайте, вортексируя в течение одной минуты. Центрифугируйте образцы со скоростью 20 000 раз больше g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

После этого шага обращайтесь с трубками осторожно, чтобы избежать смешивания двух жидких фаз и не разрушить осажденные гранулы. На этом этапе на дне трубки находятся две допустимые жидкие фазы с твердой гранулой. Неполярная верхняя фаза содержит липиды.

Нижняя водная фаза содержит полярные и полуполярные метаболиты. Гранулы содержат белки, крахмалы и клеточную стенку. Перелейте 500 микролитров растворителя из верхней липидсодержащей фазы в маркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Затем с помощью пипетки объемом 200 микролитров осторожно удалите остатки липидной фазы и выбросьте ее. Затем перелейте 400 микролитров растворителя из нижней фазы в промаркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Переложите дополнительную аликвоту в 200 микролитров в микрофуговую пробирку для выполнения дальнейшего анализа, такого как анализ метаболитов на основе газовой хроматографии.

Удалите и выбросьте оставшуюся водную фазу, отпишивая избыточный объем. Затем, чтобы промыть полученную гранулу белково-крахмало-клеточной стенки, добавьте 500 микролитров метанола и затем переведите его на одну минуту. Центрифугируйте образцы со скоростью 10 000 раз больше g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Испаряйте растворитель из образцов липидов с помощью проточного испарителя азота, чтобы избежать окислительных изменений липидов. Полученные высушенные образцы следует немедленно проанализировать. Растворитель выпарить из водных образцов в течение ночи в вакуумном концентраторе без нагрева.

Высушенные водные образцы могут храниться в течение нескольких недель при температуре минус 80 градусов Цельсия перед анализом. Повторно суспендируйте высушенные липидные фракции в 400 микролитрах раствора 7-3 ацетонитрила до 2-пропанола. Перелейте достаточное количество жидкости в стеклянные флаконы и плотно закупорьте крышкой.

Затем поместите стеклянные флаконы в охлажденный автопробник при температуре четыре градуса Цельсия. Введите два микролитра на образец и отделите липиды в колонке с обратной фазой C8, удерживаемой при температуре 60 градусов Цельсия, с помощью системы UPLC, работающей со скоростью потока 400 микролитров в минуту. Для хроматографической сепарации используйте подвижные фазы, описанные в таблице 1 сопроводительного документа.

Получение масс-спектров в режиме положительной и отрицательной ионизации с помощью подходящего прибора MS, охватывающего диапазон масс от 150 до 1500 отношения заряда к массе. Повторно суспендируйте полярную фазу в 200 микролитрах раствора метанола класса UPLC в воде. Перелейте достаточное количество жидкости в стеклянные флаконы и плотно закупорьте крышкой.

Затем поместите стеклянные флаконы в охлажденный автопробник, четыре градуса Цельсия. Введите два микролитра из каждого образца и отделите метаболиты в колонке RP C-18 при температуре 40 градусов Цельсия с помощью системы UPLC, работающей со скоростью потока 400 микролитров в минуту. Используйте подвижные фазы для хроматографической сепарации с параметрами, приведенными в таблице 2 сопроводительного документа.

Получение полного сканирования масс-спектров в режиме положительной и отрицательной ионизации с помощью подходящего масс-спектрометра, охватывающего диапазон масс от 50 до 1500 отношения массы к заряду. Наконец, выполните экстракцию, переваривание и анализ белка, как описано в сопроводительном документе. 25 миллиграммов ткани листьев арабидопсиса были собраны, измельчены и экстрагированы перед тем, как подвергнуть их трем аналитическим платформам UPLC-MS.

Полярные и полуполярные первичные и вторичные метаболиты были проанализированы из полярной фазы с помощью обращенной фазы C-18 UPLC-MS. Базовые пиковые хроматограммы липидов, показанные на верхней панели, и полуполярные метаболиты, показанные на нижней панели, были проанализированы в режиме положительной ионизации. Круговая диаграмма в правом верхнем углу каждой хроматограммы показывает количество идентифицированных липидов и метаболитов, относящихся к различным химическим классам.

Например, 58 различных липидов были отнесены к группе триацилглицеридов, обозначенной в верхней таблице как TAG. Большее количество гидрофильных метаболитов из этой фракции, таких как сахара и полярные аминокислоты, которые не демонстрируют хорошего удержания на материале с обратной фазой, могут быть проанализированы с помощью других аналитических методов, таких как GCMS или жидкостная хроматография с гидрофильным взаимодействием. Белки, которые были получены в результате экстракции, были в растворе расварены и проанализированы с помощью дробовика LCMS.

Круговая диаграмма, показанная в правом верхнем углу, показывает количество идентифицированных белков, отнесенных к различным биологическим процессам. Например, 268 белков были отнесены к категории локализации. Таким образом, более 200 видов липидов, 50 аннотированных полуполярных метаболитов и несколько тысяч белков могут быть регулярно идентифицированы из образцов, подобных использованному в этом примере.

Кроме того, метод показал широкую применимость с использованием различных тканей, органов и материала клеточных культур. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как извлекать и анализировать наиболее важные соединения из одного образца. При попытке выполнить эту процедуру важно сохранить все образцы замороженными, правильно измельчить материал и использовать растворители и химикаты аналитического класса.

Следуя этой процедуре, можно использовать все аналитические методы для определения молекулярного состава экстрагированных образцов.