Простой фракционированный метод экстракции для комплексного анализа метаболитов, липидов и белков из одного образца

Общая цель данного метода заключается в выделении и анализе всех основных молекулярных компонентов, включая полярные и полуполярные метаболиты, липиды и белки, из одного образца с помощью простого фракционированного экстрагирования метил-трет-бутиловым эфиром. Как правило, ученые сталкиваются с трудностями при анализе нескольких классов соединений из одного и того же образца. С помощью метода экстракции MTBE, представленного здесь, можно выделить и проанализировать несколько классов соединений, таких как липиды, метаболиты и белки, используя один образец.

Основным преимуществом данной методики является возможность надежного извлечения всех классов молекулярных соединений из небольшого объема одной аликвоты образца. Этот метод помогает ответить на фундаментальные вопросы системной биологии, так как создает экспериментальную базу для мультиомиксного анализа, позволяя получать фракции, которые могут быть использованы для протеомного, липидомного и метаболомного анализов. Следующий протокол продемонстрирован на примере тканей листьев Arabidopsis.

Arabidopsis — это небольшие цветковые растения семейства Brassicaceae, родственные капусте. Начните выполнение данной процедуры с предварительного охлаждения держателей трубок гомогенизатора тканей в жидком азоте в течение не менее 10 минут. Извлеките образцы из жидкого азота и поместите их в держатели трубок.

Затем извлеките держатели пробирок из жидкого азота. Быстро поместите их в гомогенизатор тканей и настройте прибор так, чтобы измельчить биологический материал в мелкий однородный порошок. Для листьев используйте частоту 20 hertz в течение одной минуты.

Время и скорость гомогенизации могут варьироваться в зависимости от типа ткани. Убедитесь, что гомогенизация продолжается до тех пор, пока полученный образец не превратится в очень мелкий порошок. На каждом этапе гомогенизации образец должен оставаться замороженным.

Гомогенизируйте образцы, затем извлеките биообразцы из держателей пробирок. Если они не будут использованы сразу, поместите их в морозильную камеру при температуре -80 °C до проведения дальнейшей экстракции. Маркируйте четыре микроцентрифужные пробирки с круглым дном и безопасным замком объемом 2 мл, указав номер образца.

Предварительно охладите пробирки и шпатели, погрузив их в жидкий азот. После охлаждения пробирок и шпателей поместите одну из пробирок на аналитические весы и с помощью шпателя перенесите 25 мг порошка ткани в микроцентрифужную пробирку. Запишите точный вес каждого образца, затем немедленно поместите навески образцов в жидкий азот.

Выполняйте этот этап быстро, чтобы избежать размораживания растительного материала. Храните аликвотированные образцы при температуре -80 °C до проведения экстракции. Для подготовки к экстракции предварительно охладите метил-трет-бутиловый эфир или смесь для экстракции MTBE-метанолом, приготовленную согласно описанию в сопроводительном документе, в морозильной камере при температуре -20 °C.

Достаньте аликвотированные образцы и добавьте по 1 mL предварительно охлажденной экстракционной смеси в каждую пробирку с образцом. Выполняйте этот шаг быстро. MTBE обладает низкой вязкостью и может выкапывать из наконечника пипетки.

Немедленно перемешайте каждый образец на вортексе до полной гомогенизации ткани в экстракционной смеси. Держите пробирки в штативе на лабораторном столе до завершения экстракции всех образцов. Этот этап является критически важным.

На данном этапе мы осаждаем белки и инактивируем их ферментативную активность. Инкубируйте все образцы на орбитальном шейкере при 100 RPM в течение 45 минут при температуре 4 °C. Затем подвергните образцы ультразвуковой обработке в течение 15 минут в охлажденной до 0 °C ультразвуковой бане.

Затем для фракционирования путем фазового разделения добавьте в каждую пробирку с образцом 650 µL раствора воды и метанола в соотношении три к одному. После этого перемешайте содержимое с помощью вортекса в течение одной минуты. Центрифугируйте образцы при ускорении 20 000 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C.

После этого этапа осторожно работайте с пробирками, чтобы избежать смешивания двух жидких фаз и не нарушить структуру осажденного пеллета. На данной стадии в пробирке присутствуют две допустимые жидкие фазы и твердый пеллет на дне. Неполярная верхняя фаза содержит липиды.

Нижняя водная фаза содержит полярные и полуполярные метаболиты. Осадок содержит белки, крахмал и клеточную стенку. Перенесите 500 µL растворителя из верхней липидной фазы в маркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 mL.

Затем с помощью дозатора на 200 мкл осторожно удалите оставшуюся липидную фазу и утилизируйте ее. Далее перенесите 400 мкл растворителя из нижней фазы в маркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Перенесите дополнительную аликвоту объемом 200 мкл в микроцентрифужную пробирку для проведения дальнейшего анализа, например, анализа метаболитов методом газовой хроматографии.

Удалите и утилизируйте остатки водной фазы, отпипетировав избыточный объем. Затем, чтобы промыть полученный осадок из белка, крахмала и клеточной стенки, добавьте 500 microliters метанола и перемешайте на вортексе в течение одной минуты. Центрифугируйте образцы при ускорении 10, 000 ×g в течение пяти минут при температуре four degrees Celsius.

Испарите растворитель из липидных образцов с помощью испарителя с потоком азота, чтобы избежать окислительных модификаций липидов. Полученные высушенные образцы следует проанализировать немедленно. Испарите растворитель из водных образцов в вакуум-концентраторе в течение ночи без нагревания.

Высушенные водные образцы могут храниться в течение нескольких недель при температуре -80 °C до начала анализа. Ресуспендируйте высушенные липидные фракции в 400 µL раствора ацетонитрила и 2-пропанола в соотношении 7:3. Перенесите необходимый объем жидкости в стеклянные флаконы и плотно закройте их крышками.

Затем поместите стеклянные флаконы в охлаждаемый автосамплер при температуре 4 °C. Введите по 2 µL каждого образца и проведите разделение липидов на колонке C8 с обращенной фазой при температуре 60 °C, используя систему UPLC со скоростью потока 400 µL/мин. Для хроматографического разделения используйте подвижные фазы, описанные в таблице 1 сопроводительного документа.

Снимите масс-спектры в режимах положительной и отрицательной ионизации с помощью подходящего масс-спектрометра в диапазоне отношения заряда к массе от 150 до 1500. Ресуспендируйте полярную фазу в 200 µL раствора метанола (сорта для UPLC) и воды в соотношении один к одному. Перенесите достаточный объем жидкости в стеклянные виалы и плотно закройте крышками.

Затем поместите стеклянные флаконы в охлажденный автосамплер при температуре 4 °C. Введите по 2 µL каждого образца и разделите метаболиты на колонке RP C-18 при температуре 40 °C с использованием системы UPLC при скорости потока 400 µL/мин. Для хроматографического разделения используйте подвижные фазы с параметрами, указанными в таблице 2 сопроводительного документа.

Получите масс-спектры полного сканирования в режимах положительной и отрицательной ионизации с помощью подходящего масс-спектрометра в диапазоне отношения массы к заряду от 50 до 1500. В завершение проведите экстракцию, переваривание и анализ белков, как описано в сопроводительном документе. 25 milligrams ткани листа Arabidopsis были собраны, измельчены и экстрагированы перед анализом на трех платформах UPLC-MS.

Полярные и полуполярные первичные и вторичные метаболиты в полярной фазе анализировали методом обращенно-фазовой C-18 UPLC-MS. Хроматограммы базовых пиков липидов (верхняя панель) и полуполярных метаболитов (нижняя панель) были получены в режиме положительной ионизации. Круговая диаграмма в верхнем правом углу каждой хроматограммы показывает количество идентифицированных липидов и метаболитов, отнесенных к различным химическим классам.

Например, 58 различных липидов были отнесены к группе триацилглицеридов, обозначенной на верхнем графике как TAG. Более гидрофильные метаболиты из этой фракции, такие как сахара и полярные аминокислоты, которые не демонстрируют достаточного удерживания на материале обращенной фазы, могут быть проанализированы другими аналитическими методами, такими как GCMS или жидкостная хроматография с гидрофильным взаимодействием. Белки, полученные в результате экстракции, подвергались перевариванию в растворе и анализировались с помощью метода shotgun LCMS.

Круговая диаграмма в верхнем правом углу показывает количество идентифицированных белков, отнесенных к различным биологическим процессам. Например, к категории локализации были отнесены 268 белков. Таким образом, в образцах, подобных использованному в данном примере, можно регулярно идентифицировать более 200 видов липидов, 50 аннотированных полуполярных метаболитов и несколько тысяч белков.

Кроме того, метод продемонстрировал широкую применимость при использовании различных тканей, органов и материалов клеточных культур. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как экстрагировать и анализировать основные соединения из одного образца. При выполнении данной процедуры важно хранить все образцы в замороженном состоянии, надлежащим образом измельчать материал и использовать растворители и химические вещества аналитической чистоты.

После выполнения данной процедуры для определения молекулярного состава экстрагированных образцов можно использовать любые аналитические методы.