Высокая пропускная способность сотовых микрочипов платформы для корреляционного анализа клеточной дифференциации и тяговых усилий
1 марта 2017 г.
Дифференциация клеток регулируется множеством микроокружения факторов, в том числе как состав матрицы и материала подложки свойствами. Здесь мы опишем метод с использованием клеточных микрочипов в сочетании с тяговой силовой микроскопии для оценки как дифференцировки клеток и биомеханические клетки с субстратом взаимодействия как функция контекста микросреды.
Общая цель этой платформы клеточных микрочипов заключается в корреляции измерений как клеточной дифференцировки, так и сил тяги в зависимости от микроокружения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области тканевой инженерии, позволяя проводить как фундаментальные исследования биологии стволовых клеток, так и оптимизировать протоколы дифференцировки. К основным преимуществам этого метода относятся его пропускная способность, способность варьировать биохимические и биофизические сигналы, а также считывание конечных точек с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и микроскопии тракционной силы (TFM).
Несмотря на то, что они использовали эти методы, те, кто понимает дифференцировку предшественников печени, могут быть легко применены к другим типам артериальных клеток и тканевым контекстам. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как успех эксперимента зависит от интеграции протокола построения матрицы как с высококачественными гидрогелевыми субстратами, так и с микроскопией силы тяги. Чтобы изготовить флуоресцентные шарики, содержащие полиакриламидные гидрогели, на силанизированной чашке Петри со стеклянным дном диаметром 35 мм для оценки взаимодействий клеточной подложки в реальном времени с помощью TFM, сначала приготовьте стеклянные подложки в растворах, как описано в текстовом протоколе.
Поместите силанизированные стеклянные чашки Петри со стеклянным дном 35 мм в стеклянный поддон для сушки и нанесите пипеткой 20 микролитров раствора преполимерных шариков 9:1 для фотоинициатора в центр каждой чашки. Аккуратно накройте каждую посуду круговой крышкой 12 мм, избегая образования пузырьков. Для того чтобы распределить флуоресцентные шарики по поверхности гидрогеля, переверните посуду и оставьте ее при комнатной температуре на 20 минут.
Все еще находясь в перевернутом положении, подвергните чашку воздействию ультрафиолетового излучения 365 нанометров в течение 10 минут. Оптимизируйте время полимеризации по мере необходимости. Далее погрузите гидрогели в 1 моляр буфера HEPES и оставьте их при комнатной температуре в темноте на ночь.
Аккуратно снимите чехлы бритвой, стараясь не повредить полимеризованные гидрогели. Обезвожьте гидрогели при температуре 50 градусов Цельсия на горячей плите до полного высыхания. Гидрогели можно хранить при комнатной температуре в темное время суток в течение трех месяцев.
Подготовьте буферы для печати биомолекул и для исходной пластины, как описано в текстовом протоколе. После загрузки чистых контактов, как описано в текстовом протоколе, подготовьте микромассив и запрограммируйте его с помощью программного обеспечения производителя. Далее включите блок увлажнителя воздуха.
Отрегулируйте заданное значение на 65% относительной влажности и подождите, пока реометр не сравняется с заданным значением. Поместите исходную пластину в соответствующий адаптер. Затем поместите обезвоженные гидрогелевые субстраты в соответствующий адаптер.
Настройте параметры программы так, чтобы они точно отражали расположение исходной пластины, дизайн массива и желаемый формат. Начните изготовление массива. Не реже одного раза в час проверяйте, чтобы влажность не опускалась ниже 65% относительной влажности и чтобы штифты не засорились.
Если влажность неожиданно упала, приостановите укладку, чтобы заполнить увлажнитель и очистить связанные с ним трубки от конденсата. Если контакты забиты, приостановите сборку, чтобы очистить контакты, или иным образом замените их предварительно очищенными контактами. После завершения программы поместите изготовленные массивы в слайд-бокс или микропластину, покрытую алюминиевой фольгой.
Оставьте массивы при комнатной температуре при относительной влажности 65% на ночь. По нашему опыту, наиболее распространенные трудности связаны с изготовлением массивов. Мы рекомендуем подтверждать техническое качество и надежность изготовленных массивов с помощью флуоресцентно меченных молекул, общих белковых красителей и иммунофлуоресцентных добавок.
На следующий день после изготовления погрузите в матрицу 35 мм чашки Петри в 3 мл 1% объема на объем пенициллин-стрептомицин в ПВС. Выдержите нанесенные подложки в ультрафиолетовое излучение в течение 30 минут. Затем замените раствор пенициллин-стрептомицина на среды для клеточных культур.
После сбора и подсчета клеток высадите их на матрицы из расчета 3 мл на чашку Петри 35 мм. Инкубируйте матричные культуры при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение от двух до 24 часов или до образования хорошо заселенных клеточных островков. Плотность и время посева могут регулироваться в зависимости от ячеек и конкретного применения.
После образования клеточных островков дважды промойте матричные культуры 3 мл предварительно подогретой среды для клеточных культур. На этом этапе в биологическую систему могут быть добавлены соответствующие средства контроля и обработки, представляющие интерес. Меняйте среды массивов каждые один-два дня для поддержания концентрации любых обработок.
В течение одного-пяти дней после начала культивирования матриц проведите оценку взаимодействий клеточного субстрата в реальном времени с помощью TFM. Переместите 35-миллиметровые чашки Петри, содержащие матричные культуры, в инкубированный инвертированный флуоресцентный микроскоп с роботизированным столиком для измерений TFM. В одной чашке отметьте положения и фокусные плоскости отдельных клеточных островков с помощью фазово-контрастной микроскопии.
Переключитесь на дальнюю красную флуоресцентную микроскопию, чтобы визуализировать бусины. Затем вернитесь к каждой из позиций, сохраненных на предыдущем шаге, и скорректируйте z-координату фокальной плоскости так, чтобы в фокусе был только первый слой бусин ниже островка клеток. Сохраните новые координаты и перейдите к автоматизированной визуализации всех клеточных островов для получения контраста фазы диссоциации и дальних красных флуоресцентных изображений.
Затем осторожно добавьте в чашку 150 микролитров раствора BSA/SDS и подождите пять минут, чтобы обеспечить полную диссоциацию клеток с субстратом. Контролируйте диссоциацию клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии. После того, как островки клеток будут отделены от подложки, вернитесь в отмеченные места и убедитесь, что первый слой бусин все еще находится в фокусе.
Если эти шарики смещены в плоскость из-за деформации, вызванной клеточным сцеплением, скорректируйте z-координату сфокусированной плоскости так, чтобы они снова оказались в фокусе. Сохраните скорректированные z-координаты и повторите автоматическую съемку всех островов, чтобы получить дальние красные флуоресцентные изображения после диссоциации. Повторите эти действия для остальных блюд.
Протеин A/G, конъюгированный с вырезом, зазубренный, а дельта-подобный один показали улучшенное удержание в гидрогелях. Презентация режекторного лиганда также способствовала дифференцировке предшественников печени в направлении судьбы клеток желчных протоков, на что указывает присутствие маркера клеток зеленого желчного протока. Реакция на Notch-лиганды была количественно определена для пяти белков внеклеточного матрикса, или ВКМ, и показала, что реакция предшественников печени на лиганды зависит от контекста ВКМ.
Малый нокдаун РНК шпильки был использован для получения предшественников без дельта-лигандов, таких как один и зазубренный. Затем клеткам представляли зазубренные лиганды с зазубренной единицей, дельта как единица и дельта как четыре. Реакция на массивный Notch-лиганд варьировала в зависимости от внутренней экспрессии клетки любого из лигандов.
Эти изображения показывают дифференцировку предшественников печени в зависимости как от жесткости субстрата, так и от состава ВКМ. Количественный анализ показал, что коллаген 4 поддерживает дифференцировку как на мягких, так и на жестких субстратах, в то время как фибронектин поддерживает дифференцировку только на жестких субстратах. Репрезентативные тепловые карты свидетельствуют о том, что устойчивое тракционное напряжение при низкой жесткости субстрата на коллагене 4 способствует дифференцировке в клетки желчных протоков.
Этот вывод был подтвержден количественной оценкой средних среднеквадратичных значений тягового напряжения. В этом видео и прилагаемом к нему протоколе представлены основные этапы изготовления гидрогелей и матриц для проведения культивирования клеток на массивных субстратах и для измерения взаимодействий клеточного субстрата с помощью микроскопии силы тяги. После ознакомления с методами каждый эксперимент может быть завершен всего за одну-две недели при правильном выполнении.
В соответствии с этим методом, клеточные культуры следует использовать для валидации условий массива с высоким баллом с использованием качественной ПЦР, иммуноблоттинга, стандартных осей механобиологии или других дополнительных методов молекулярной биологии. Эта универсальная платформа может быть применена для высокопроизводительного исследования клеточных функций в широком спектре клеточных и тканевых контекстов, включая дифференцировку стволовых клеток и биологию раковых клеток.
Обзор
Это исследование представляет платформу микрочипов клеток, разработанную для корреляции дифференциации клеток и сил тяги в различных контекстах микросреды. Метод улучшает понимание биологии стволовых клеток и применений в тканевой инженерии.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Тканевая инженерия
- Биомеханика
Фон
- На дифференцировку клеток влияют факторы микросреды.
- Микросcopia сил тяги (TFM) используется для оценки взаимодействий клетка-субстрат.
- Методы высокой пропускной способности необходимы для прогресса в исследованиях стволовых клеток.
- Интеграция биохимических и биофизических сигналов критически важна для успеха эксперимента.
Цель исследования
- Оценить дифференцировку клеток и биомеханические взаимодействия.
- Оптимизировать протоколы дифференцировки для различных типов клеток.
- Предоставить визуальную демонстрацию техники микрочипа.
Используемые методы
- Изготовление гидрогелевых полиакриламидов с флуоресцентными шариками.
- Печатание микрочипов биомолекул.
- Культивирование клеток и засев на созданных массивах.
- Живая оценка взаимодействий клетка-субстрат с использованием TFM.
Основные результаты
- Метод позволяет следить за поведением клеток в реальном времени.
- Демонстрируется успешная дифференцировка клеток-предшественников печени.
- Можно изготовить высококачественные массивы с согласованными результатами.
- TFM предоставляет представление о механических свойствах взаимодействий клеток.
Выводы
- Платформа микрочипов клеток является ценным инструментом для исследований стволовых клеток.
- Она позволяет исследовать различные типы клеток и их дифференцировку.
- Будущие применения могут распространиться на другие тканевые контексты.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This platform enables high-throughput correlation of biochemical and biophysical cues in stem cell differentiation, addressing a key challenge in tissue engineering and regenerative medicine. By integrating immunofluorescence and traction force microscopy, it provides quantitative, multiparametric readouts that enhance predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking. The system supports scalable screening of microenvironmental factors, informing go/no-go decisions in preclinical pipeline advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating differentiation outcomes with subcellular traction forces under defined microenvironmental conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation through high-throughput screening of ECM proteins and ligand combinations in a controlled, reproducible format.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying how substrate stiffness and biochemical cues jointly influence cell fate decisions, reducing ambiguity in target mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative datasets on cell differentiation and traction forces, enabling reliable compound or ligand evaluation across arrayed conditions.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized hydrogel fabrication, controlled humidity during printing, and validated bead-based TFM readouts.
- Scalability Value: Compatible with microarray printing workflows, allowing parallel testing of dozens of microenvironmental combinations per slide for efficient lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates disease-relevant applicability in liver progenitor differentiation, with direct readouts of bile duct cell fate via immunofluorescence and biomechanical metrics.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-scale mechanistic insights with preclinical validation by providing multiparametric data on differentiation efficacy and mechanobiological responses.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables prioritization of conditions that show sustained traction stress and differentiation on permissive matrices, supporting data-driven advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for targets where mechanotransduction influences efficacy or toxicity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effects of arrayed biochemical and biophysical variables on cell differentiation and force generation.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs via immunofluorescence and TFM, enabling quantitative comparison of microenvironmental conditions.
- Analytics: Provides multiparametric readouts (fluorescence intensity, traction stress RMS) that allow teams to rank conditions by differentiation efficacy and mechanical phenotype.
- Translational Research: Connects to preclinical work through validated, disease-relevant cell models and measurable biomechanical endpoints predictive of tissue-level behavior.
- Enterprise Reuse: Fabricated hydrogel substrates are storable and reusable across projects, positioning the platform as a scalable, cross-disciplinary capability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms by reducing mechanistic ambiguity through correlated biochemical and biomechanical profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled hydrogel fabrication, environmental monitoring during arraying, and validated dissociation/re-imaging workflows for TFM.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of microenvironmental conditions, reducing reliance on low-throughput, sequential validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying conditions with concordant differentiation and biomechanical responses, informing advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microarray printing, and traction force microscopy setup and calibration.
- Dependent on access to UVA/UVC exposure systems, humidified arraying platforms, and inverted fluorescent microscopes with robotic stages.
- Necessitates cross-team standardization of array fabrication protocols, including humidity control, pin maintenance, and substrate storage conditions.
- Adaptation to alternative cell types may require optimization of seeding density, culture duration, and dissociation conditions.
- Practical limitations include the need for careful bubble avoidance during hydrogel polymerization and validation of array quality via fluorescent labeling prior to cell culture.
