Первоначальная оценка антител конъюгаты изменения с пептидами вирусный производные для повышения сотовой накопления и ориентации опухоли

Общая цель этих процедур заключается в оценке специфичности и эффективности конъюгатов антител для накопления внутри клеток-мишеней и опухолей на начальных стадиях развития, чтобы в конечном итоге их можно было использовать в клинике. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос о сопряженных полях, таких как эффективность ядерной локализации и общее межклеточное накопление. Преимущество этого метода заключается в том, что с помощью ПЭТ-визуализации исследователи могут оценить эффективность и селективность конъюгатов антител-кандидатов.

Применение этих методов распространяется на терапию и диагностику рака, поскольку неэффективное накопление опухолевых клеток является основным ограничением этих применений для конъюгатов антител. После синтеза конъюгата антител последовательности ядерной локализации колиевой кислоты в соответствии с текстовым протоколом обрабатывают клетки-мишени TF1A 200 наномолярным конъюгатом антител MLS к колиевой кислоте 7G3. Включают клетки, обработанные модифицированными контрольными моноклональными антителами.

Инкубировать пять раз по 10 до шестой антиген-положительных клеток с конъюгатами при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем удалите надосадочную жидкость и используйте один миллилитр ледяного PBS для трех промывки клеток. Добавьте свежую среду и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение дополнительного часа.

Затем добавьте 0,5 миллилитра PBS, содержащего 0,25% трипсина и ЭДТА, и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем используйте 1,5 миллилитра RPMI1640 среды с 10% FBS для нейтрализации трипсина. Центрифугируйте клетки при 500 перегрузках в течение пяти минут, удалите надосадочную жидкость и используйте 0,5 миллилитра ледяного PBS, чтобы промыть клетки еще три раза.

Добавьте в клетки 0,5 миллилитра 1% PFA и 1% сахарозы и PBS, и поместите их на лед на 30 минут для их фиксации. Затем используйте 0,5 миллилитра ледяного PBS, чтобы промыть клетки три раза, и центрифугируйте образцы при температуре 250 G в течение пяти минут. Далее добавьте в клетки 0,15% Triton X-100 и PBS, и пропитайте их на льду в течение пяти минут.

Затем с помощью ледяного PBS промойте ячейки и повторите центрифугирование. Суспендируйте клетки в 0,1 миллилитрах PBS, содержащих два микрограмма на миллилитр антизеркального вторичного поликлонального антитела FC, конъюгированного с Alexa Fluor 647, и инкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение одного часа. Центрифугируйте клетки при температуре 250 G в течение пяти минут и используйте 0,5 миллилитра ледяного PBS для трех промывки клеток.

Затем суспензируйте клетки в 0,5 миллилитрах PBS. Добавьте в клетки 10 микрограммов на миллилитр йодида пропидия. Затем с помощью монтажного носителя установите один раз от 10 до пятой ячейки на предметное стекло перед тем, как накрыть образец стеклозащитным стеклом.

Исследуйте клетки с помощью масляно-иммерсионного объектива Plan APO 60X, числовая апертура 1,42, на инвертированном лазерно-сканирующем конфокальном микроскопе. Детектирование ПИ флуоресценции с помощью аргонового лазера с длиной волны 488 нм и набора спектральных сканирующих призм для диапазона от 600 до 650 нанометров. Для флуоресценции AF 647 используйте гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм и набор спектрально-сканирующих призм для 650–700 нанометров.

Последовательный сбор изображений с PI и AF 647 с разрешением 1024 x 1024 пикселей с 2-кратным усреднением линий с интервалом 0,5 микрона по всей толщине ячейки. Представляйте изображения в виде проекций Z. Чтобы проанализировать клетки, оценить и записать, является ли внутриклеточная флуоресценция в цитоплазме групповой и вблизи поверхности клетки или диффузной и однородной.

Также оцените относительную интенсивность флуоресценции на клетку. После приготовления и концентрирования конъюгата антител к колиевой кислоте NLS с радиоактивной меченой колиевой кислотой в соответствии с текстовым протоколом определяют эффективность радиоактивного мечения путем нанесения 0,5 микролитра 0,1-молярного цитрата натрия PH5,5, или элюента ITLC, на полоску ITLC. Сформируйте авторентгенограмму полоски, и получите цифровое изображение.

Проводят денситометрию для получения пропорции связанной и свободной меди-64. Если содержание свободной меди-64 превышает 5%, сконцентрируйте образец дальше. Для исследований клеточного накопления меди-64 обрабатывайте клетки 100 наномолярами меченых медью-64 конъюгатов A14 при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного, шести и 24 часов, как описано ранее.

Обрабатывайте клетки немодифицированным A14 для блокирования альфацитов IL5R и при четырех градусах Цельсия для блокирования рецептор-опосредованной интернализации. После промывки клеток и инкубации со свежей средой, как было показано ранее в этом видео, добавьте 0,5 миллилитра PBS, содержащего 0,25% трипсина и ЭДТА, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Затем, нейтрализовав и промыв клетки, как и раньше, добавьте в клетки буфер для лизиса плазматической мембраны, и инкубируйте их на льду в течение 10 минут.

Центрифугируйте лизированные плазматической мембраной клетки при 90-кратном G в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и переложите ее в свежую трубку. Это представляет собой цитоплазматическую фракцию.

Затем используйте ледяной PBS, чтобы промыть ядра три раза, и добавьте промывки к цитоплазматической фракции. Убедитесь, что флаконы, содержащие ядерную и цитоплазматическую фракции, запечатаны, а затем поместите их в гамма-счетчик, откалиброванный для меди-64, чтобы перевести исходные данные в мегабекарил. Определение качества выделения ядер путем проведения вестерн-блоттинга на ламин АС, ограниченный ядерный белок; и Rab-7, распространенный цитоплазматический белок, на оптовых лизатах, ядерных и цитоплазматических фракциях.

Обрабатывайте от пяти до 10 до шести клеток 500 микролитрами радиоаминопреципитационного анализа, или буфера RIPA, и буфером для лизиса плазматической мембраны, содержащим 1%2% и 4% NP-40. Кроме того, обработайте выделенные ядра 500 микролитрами буфера RIPA для получения выделенных ядерных белков. Добавьте в четыре раза больший объем образца холодного ацетона к изолированным ядерным, цитоплазматическим и оптовым белкам и инкубируйте в течение 60 минут при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Центрифугируйте образцы при 13 000 умноженных на G в течение 10 минут. Сцедите надосадочную жидкость, стараясь не выбить белковую гранулу. Затем добавьте 100 микролитров PBS для растворения белков.

После выполнения вестерн-блоттинга, как описано ранее, разрежьте мембрану пополам на отметке молекулярной массы 40 килодальтон. Используйте антитела, специфичные к ламин-AC, для зондирования блоттинга, содержащего белки с более высокой молекулярной массой, и используйте антитела, специфичные для Rab-7, для зондирования нижней половины мембраны. В группах, состоящих из четырех мышей-нодскетов, введите в хвостовую вену от 20 до 30 мкг радиоактивно меченного конъюгата антител к колиевой кислоте А14 NLS, меченного радиоактивным излучением A14 NLS и радиоактивно меченного A14.

В тот же день поместите цилиндрический фантом, содержащий пять мегабекарилов меди-64, в ПЭТ-сканер, чтобы преобразовать количество радиоактивных веществ в секунду в введенную дозу на грамм ткани. Через 48 часов, после обезболивания мышей в соответствии с текстовым протоколом, быстро перенесите мышь на стол ПЭТ-сканера в положение лежа головой вперед с носовым конусом для изофлурана. Начните сбор данных с помощью ПЭТ, используя обычную настройку режима выборки и энергетическое окно от 250 до 650 килоэлектронвольт.

После сканирования извлеките мышь из сканера и поместите ее обратно в клетку. Как показано на этом рисунке, стрелками показана разница при оценке накопления конъюгата антител с трипсинизацией и без нее. В клетках, которые не трипсинизированы, внутриклеточное накопление и распределение трудно оценить из-за чрезмерной экспрессии поверхностных рецепторов клетки-мишени.

Стрелками показана разница во внутриклеточном накоплении и распределении двух кандидатов на конъюгат антител при правильном трипсинизации клеток. Меченый радиоактивными веществами конъюгат антител к колиевой кислоте A14 NLS демонстрирует наномолярное сродство к IL5R альфа. С увеличением конъюгата антител к колиевой кислоте А14 NLS с радиоактивными метками специфическое связывание конъюгата антител к колиевой кислоте А14 NLS приближалось к насыщению при концентрациях 3,5 наномоляров в клетках HT-1376 и HT-B9.

Гамма-подсчет показывает, что увеличение радиоактивности в ядре и в цитоплазме от меченого радиоактивными конъюгатом антител к колиевой кислоте A14 NLS является специфичным и увеличивается со временем. Клетки HT-1376 и HT-B9 инкубировали с буфером для лизиса плазматической мембраны, содержащим 1%2% или 4% NP-40. Для клеток HT-1376 и HT-B9 буфер для лизиса, содержащий один или 2% NP-40 Rap-7, не был обнаружен в ядерной фракции, а ламин AC не был обнаружен в цитоплазматической фракции.

ПЭТ-визуализация позволяет оценить конъюгаты антител-кандидатов на предмет их способности нацеливаться на антиген-положительные опухоли, красные и синие стрелки, а также связанные с ними свойства биораспределения по сравнению с родительскими антителами, не модифицированными пептидами. Можно увидеть накопление сигнала в опухоли, что помогает выбрать потенциал для конъюгата антитела. ПЭТ-визуализация также позволяет оценить поглощение конъюгата антителами в здоровых тканях, таких как печень.

Освоив эти методы, исследователи в области таргетной доставки молекулярных полезных нагрузок в опухоль смогут исследовать дополнительные агенты, в которых накопление опухолевых клеток затруднено из-за захвата эндосом.