Сотовая редокс-профилирование с использованием высококонцентрированной микроскопии

Общая цель данного метода на основе микроскопии с высоким содержанием анализа заключается в одновременном количественном определении морфофункции митохондрий и клеточных уровней активных форм кислорода для создания надежного редокс-профиля клеточных линий, подвергнутых различным экспериментальным воздействиям. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы редокс-биологии, например, вызывают ли патогенные состояния или воздействие соединений окислительный стресс и в какой степени при этом нарушаются форма и функция митохондрий. Основным преимуществом данной методики является возможность измерения всех параметров в одной и той же клетке одновременно.

Для начала процедуры высейте от 8 000 до 10 000 дермальных фибробластов человека в 60 внутренних лунок черного 96-луночного планшета с тонким сплошным дном из полистирола или стекла. При использовании различных условий, методов обработки или клеточных линий распределяйте места их высева по планшету равномерно, чтобы минимизировать краевые эффекты. Затем высейте еще от 8 000 до 10 000 клеток в лунку B01, которая будет использоваться для настройки фокуса.

Затем заполните пустые внешние лунки средой, чтобы минимизировать градиенты между лунками и окружающей средой. Перед тем как вернуть планшет в инкубатор, осторожно постучите по нему три раза, чтобы предотвратить очаговый рост клеток. Культивируйте клетки в течение 24 часов или до достижения 70% конфлюэнтности.

После этого сохраните информацию об условиях обработки для эксперимента в таблицу под названием setup. Для настройки микроскопа сначала откалибруйте предметный столик XY с помощью программного обеспечения. Затем создайте протокол визуализации для многолуночного планшета, используя программное обеспечение для сбора данных.

Данный протокол позволяет автоматически определять заданные позиции и выбранные лунки планшета на 96 лунок. Теперь выберите соответствующий тип многолуночного планшета из списка доступных планшетов, представленного в программном обеспечении. В качестве альтернативы можно определить формат многолуночного планшета, указав размеры планшета и лунок.

Затем выровняйте планшет, определив два угла из четырех крайних лунок. После этого выберите лунки, данные из которых необходимо получить, и определите протокол сбора данных, состоящий из последовательного сбора при разных длинах волн. Убедитесь, что канал GFP установлен первым.

Затем определите цикл обхода планшета для получения четырех равномерно распределенных неперекрывающихся изображений, расположенных вокруг центра каждой выбранной лунки, используя заданный протокол сбора данных. На этом этапе приготовьте красящий раствор для 60 лунок, добавив стоковые растворы CM-H2DCFDA и TMRM в буфер HBSS HEPES. Затем удалите культуральную среду из клеток, перевернув планшет одним плавным движением.

Аккуратно промойте клетки дважды буфером HH. Не забудьте про лунку A01 с клетками, которые использовались для настройки фокуса. Удаляйте буфер HH между этапами промывки.

Затем проведите нагрузку клеток красителями CM-H2DCFDA и TMRM, добавив по 100 microliters окрашивающего раствора в каждую лунку. Снова не забудьте про лунку A01. Инкубируйте клетки в течение 25 минут в темноте при комнатной температуре.

Через 25 минут дважды промойте клетки 100 µL буфера HH и добавьте по 100 µL буфера HH во все 60 внутренних лунок. Для проведения измерения установите планшет в микроскоп. Затем включите аппаратную систему автофокусировки и с помощью лунки B01 и канала TMRM отрегулируйте смещение автофокуса до получения четкого изображения.

Затем запустите протокол визуализации. Полученный набор данных изображений позволит определить базовые уровни АФК, митохондриальный мембранный потенциал и морфологию митохондрий. Далее, для измерения индуцированных уровней АФК, осторожно извлеките 96-луночный планшет из микроскопа.

Добавьте 100 µL раствора TBHP в концентрации 40 µM в каждую лунку и подождите не менее трех минут для завершения реакции TBHP с CM-H2DCFDA. В течение этого времени добавьте 100 µL рабочего раствора антител в лунку A01. Затем снова установите планшет на микроскоп и повторно проверьте фокусировку, используя лунку B01.

Затем зафиксируйте те же позиции, что и в первом раунде визуализации, используя тот же протокол визуализации. Полученный набор данных изображений предоставит информацию об индуцированных уровнях АФК. Далее получите изображения плоского поля в лунке A01.

Убедитесь, что сигналы находятся в пределах динамического диапазона, отрегулировав настройки сбора данных. После этого экспортируйте полученные наборы данных в одну папку в виде отдельных TIFF-файлов, используя стандартизированную номенклатуру.

Это включает ссылку на планшет, указание на период до или после обработки TBHP, лунку, поле и канал, разделенные нижним подчеркиванием. Также сохраните изображения плоского поля в той же папке в виде отдельных TIFF-файлов, используя стандартную номенклатуру. На этом этапе откройте программное обеспечение для обработки изображений и установите набор макросов для расчета окислительно-восстановительных показателей.

Затем откройте интерфейс настройки, нажав кнопку S, чтобы задать параметры анализа. Выберите тип изображения, количество каналов и лунку, которая использовалась для получения изображений плоского поля. После этого укажите, в каком канале находятся клетки или митохондрии.

Отметьте флажки «background» (фон) и «enhance» (улучшение) для выполнения вычитания фона и адаптивного выравнивания гистограммы с ограниченным контрастом соответственно. Затем определите значение сигма для гауссова размытия клеток и лапласовского усиления митохондрий. Выберите алгоритм автоматического определения порога и укажите пределы исключения по размеру.

Затем проверьте настройки сегментации на нескольких выбранных изображениях из полученных наборов данных, открыв их и нажав кнопки C или M в меню для сегментации клеток или митохондрий соответственно. После этого запустите пакетный анализ интересующей папки, нажав кнопку решетки и выбрав папку с изображениями. Проверьте настройки и нажмите ок.

После пакетного анализа визуально проверьте качество сегментации на проверочном стеке, нажав кнопку V и выбрав папку с изображениями. Просмотрите проверочный стек, чтобы подтвердить успешность сегментации. Первичный анализ извлеченных данных выполняется автоматически с помощью бесплатного приложения Shiny.

Это позволяет быстро интерпретировать результаты. Для начала откройте приложение в R Studio. Выберите запуск во внешнем браузере.

На странице ввода выберите каталог, в котором находятся файлы с результатами. Убедитесь, что в этом каталоге также присутствует файл настроек. Файлы с результатами и данные настроек импортируются, компилируются и визуализируются автоматически.

На странице с экспериментальной установкой показана схема эксперимента. На следующей странице отображаются уровни АФК, а также несколько митохондриальных параметров для каждого планшета по отдельности. Выберите планшет, который вы хотите визуализировать, с помощью выпадающего меню.

Данные представлены в формате многолуночного планшета, а также в виде диаграмм размаха («ящиков с усами»), где выбросы обозначены номером лунки и изображения. На странице с результатами всего эксперимента показаны нормализованные результаты по всем объединенным планшетам вместе с базовым статистическим анализом. Если через страницу ввода предоставлен файл исключений (drop file), указанные точки данных будут исключены.

На странице кластерного анализа формируется чувствительный редокс-профиль с использованием метода главных компонент и анализа данных по пяти параметрам. Наконец, страница загрузки данных позволяет сохранить обработанные и переупорядоченные данные для дальнейшего использования. Здесь представлены результаты эксперимента, в котором дермальные фибробласты человека обрабатывали ингибитором протеазы ВИЧ саквинавиром.

При использовании описанного протокола было обнаружено значительное повышение как базального, так и индуцированного уровней АФК по сравнению с контрольными клетками, обработанными DMSO. Сакинавир также оказал существенное влияние на морфофункциональное состояние митохондрий.

Митохондриальный мембранный потенциал, измеренный как средний сигнал TMRM на один митохондриальный пиксель, значительно увеличился. Кроме того, митохондрии приобрели сильно фрагментированный характер, что количественно выражалось в более высокой круглости и меньшем среднем размере отдельных митохондрий. При объединении вышеупомянутых параметров с помощью метода главных компонент контрольное условие и условие с применением саквинавира удалось четко разграничить по их редокс-профилям.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что само освещение вызывает окислительный стресс. Поэтому следует минимизировать условия экспозиции и поддерживать их неизменными на протяжении всего эксперимента. После освоения метода за один день можно окрасить и проанализировать до 20 планшетов на 96 лунок.

После второго раунда визуализации клетки можно зафиксировать и использовать для последующего иммунофлуоресцентного окрашивания. Это позволяет увеличить количество измеряемых параметров на одних и тех же клетках и ответить на дополнительные вопросы. После просмотра этого видео вы сможете проводить комбинированные измерения АФК и морфофункции митохондрий в адгезивных клеточных культурах с помощью микроскопии с высоким содержанием данных.