Сотовая редокс-профилирование с использованием высококонцентрированной микроскопии

Общая цель этого метода, основанного на микроскопии с высоким содержанием микроскопии, состоит в том, чтобы одновременно количественно оценить морфофункцию митохондрий и клеточные уровни активных форм кислорода, чтобы установить надежный окислительно-восстановительный отпечаток для клеточных линий, подвергшихся различным экспериментальным возмущениям. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы окислительно-восстановительной биологии, такие как вызывают ли патогенные условия или комплексные методы лечения окислительный стресс, и в какой степени это влияет на форму и функцию митохондрий. Основное преимущество этой методики заключается в том, что все параметры могут быть измерены в пределах одной ячейки в одно и то же время.

Чтобы начать процедуру, засейте от 8 до 10 000 дермальных фибробластов человека в 60 внутренних лунок черной 96-луночной пластины с тонким дном из непрерывного полистирола или стекла. При использовании различных условий, обработок или клеточных линий равномерно распределяйте места их посева на планшете, чтобы свести к минимуму эффект планшета. Затем засейте еще от 8 до 10 000 клеток в лунку B01, которые будут использоваться для корректировки фокусировки.

Впоследствии заполните пустые внешние колодцы средой, чтобы свести к минимуму уклоны между колодцами и окружающей средой. Осторожно постучите по пластине три раза, прежде чем поместить ее обратно в инкубатор, чтобы клетки не разрастались пятнами. Культивируйте клетки в течение 24 часов или до тех пор, пока они не достигнут 70% конфлюенции.

После этого сохраните информацию о лечении для эксперимента в электронной таблице под названием setup. Чтобы настроить микроскоп, сначала откалибруйте двухкоординатный столик с помощью программного обеспечения. Затем создайте протокол визуализации для многолуночной пластины с помощью программного обеспечения для сбора данных.

Этот протокол позволяет автоматически регистрировать заданные положения и выбранные лунки 96-луночной пластины. Теперь выберите правильный тип многолуночной пластины из списка доступных пластин, предоставленных в программном обеспечении. В качестве альтернативы можно задать формат многолуночной пластины с помощью размеров пластины и лунки.

Затем выровняйте пластину лунки, определив два угла из четырех внешних угловых лунок. После этого выберите скважины, которые необходимо обработать, и определите протокол сбора данных, состоящий из последовательного сбора данных о длине волны. Сначала убедитесь, что установлен канал GFP.

Затем определите петлю скважинной пластины для получения четырех регулярно расположенных изображений без перекрытия, расположенных вокруг центра каждой выбранной скважины, с использованием определенного протокола сбора. На этом этапе приготовьте раствор для окрашивания для 60 лунок, добавив CM-H2DCFDA и стоковый раствор TMRM в буфер HBSS HEPES. Затем отбросьте питательную среду из клеток, перевернув планшет вверх дном одним жидким движением.

Аккуратно промойте ячейки дважды буфером HH. Не забудьте хорошо про A01 с ячейками, используемыми для регулировки фокуса. Выбросьте буфер HH между этапами стирки.

Затем загрузите элементы CM-H2DCFDA и TMRM, добавив по 100 микролитров раствора для окрашивания в каждую лунку. Опять же, не забывайте хорошо про A01. Инкубируйте клетки в течение 25 минут в темноте при комнатной температуре.

Через 25 минут дважды промойте клетки 100 микролитрами HH-буфера и добавьте 100 микролитров HH-буфера во все 60 внутренних лунок. Чтобы выполнить реальное измерение, установите пластину на микроскоп. Затем включите аппаратную систему автофокусировки и отрегулируйте смещение автофокусировки с помощью скважины B01 и канала TMRM до получения четкого изображения.

Затем запустите протокол визуализации. Полученный набор данных изображений предоставит информацию о базальных уровнях АФК, потенциале митохондриальной мембраны и морфологии митохондрий. Далее, чтобы измерить индуцированные уровни АФК, осторожно извлеките 96 луночный планшет из микроскопа.

Добавьте 100 микролитров раствора TBHP в концентрации 40 микромоляров в каждую лунку и подождите не менее трех минут, чтобы обеспечить полную реакцию TBHP с CM-H2DCFDA. За это время добавьте 100 микролитров рабочего раствора антитела в лунку А01. Теперь установите пластину обратно на микроскоп и снова проверьте фокус с помощью лунки B01.

Затем получите те же позиции, что и в первом раунде визуализации, используя тот же протокол визуализации. Полученный набор данных изображений предоставит информацию об уровнях индуцированных АФК. Затем получите изображения плоского поля в скважине A01.

Убедитесь, что сигналы находятся в пределах динамического диапазона. Путем корректировки параметров сбора данных. После этого экспортируйте полученные наборы данных в одну папку в виде отдельных файлов TIFF, используя стандартизированную номенклатуру.

Это включает в себя ссылку на пластину, до или после обработки TBHP, скважину, поле и канал, разделенные символами подчеркивания. Кроме того, сохраняйте изображения плоского поля в той же папке, что и отдельные файлы TIFF, используя стандартизированную номенклатуру. На этом шаге откройте программное обеспечение для обработки изображений и установите набор макросов редокс-метрик.

Затем откройте интерфейс настройки, чтобы задать параметры анализа, нажав на кнопку S. Выберите тип изображения, количество каналов и лунку, из которой были получены изображения плоского поля. После этого укажите, в каком канале находятся клетки или митохондрии.

Отметьте флажками фон и улучшение, чтобы выполнить адаптивное выравнивание гистограммы фона и контраст соответственно. Затем определите сигму для гауссова и размытия клеток и лапласова усиления митохондрий. Выберите алгоритм автоматического порогового значения и заполните пределы исключения размера.

Затем протестируйте настройки сегментации на нескольких выбранных изображениях полученных наборов данных, открыв их и нажав кнопки C или M в меню сегментации клеток или митохондрий соответственно. После этого из пакетного анализа перейдите по интересующей папке, нажав на кнопку решетки и выбрав папку с изображениями. Проверьте настройки и нажмите OK.

После пакетного анализа визуально проверьте производительность сегментации на проверочном стеке, нажав на кнопку V и выбрав папку с изображениями. Просмотрите стек проверок, чтобы убедиться, что сегментация прошла успешно. Первоначальный анализ извлеченных данных выполняется автоматически с помощью бесплатного приложения Gini.

Это позволяет быстро интерпретировать результаты. Для начала откройте приложение в R Studio. Выберите запуск во внешнем браузере.

На странице ввода выберите директорию, в которой находятся файлы результатов. Убедитесь, что установочный файл также присутствует в этом каталоге. Файлы результатов и информация о настройке автоматически импортируются, компилируются и визуализируются.

На странице настройки эксперимента отображается схема проведения эксперимента. На следующей странице отображаются уровни АФК, а также несколько митохондриальных параметров для каждой пластины в отдельности. Выберите пластину, которую вы хотите визуализировать, с помощью выпадающего меню.

Данные отображаются в формате многолуночных планшетов, а также в виде ящичковых диаграмм с выбросами, помеченными скважиной и номером изображения. На странице с результатами эксперимента показаны нормализованные результаты со всех планшетов вместе с базовым статистическим анализом. Если файл перетаскивания передается через страницу ввода, указанные точки данных будут исключены.

На странице кластерного анализа чувствительный окислительно-восстановительный профиль составляется с использованием главного компонента и анализа данных по пяти параметрам. Наконец, страница загрузки данных позволяет сохранить обработанные и переупорядоченные данные для дальнейшего использования. Здесь представлены результаты эксперимента, в котором дермальные фибробласты человека обрабатывались ингибитором протеазы ВИЧ саквинавиром.

При использовании описанного протокола было выявлено достоверное повышение как базального, так и индуцированного уровней АФК. По сравнению с контрольными клетками, обработанными ДМСО. Саквинавир также значительно повлиял на морфофункцию митохондрий.

Потенциал митохондриальной мембраны, измеряемый как средний сигнал TMRM на митохондриальный пиксель, значительно увеличивался. Кроме того, митохондрии приобрели сильно фрагментированный рисунок, на что количественно указывает более высокая круговость и меньший средний размер отдельных митохондрий. При объединении вышеупомянутых параметров с помощью принципиально-компонентного анализа как контрольные, так и саквинавирские условия могут быть четко отделены друг от друга по их окислительно-восстановительным отпечаткам.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что освещение само по себе вызывает окислительный стресс. Поэтому условия воздействия должны быть сведены к минимуму и поддерживаться постоянными на протяжении всего эксперимента. После освоения можно окрашивать и приобретать до 20 96 луночных планшетов за один день.

После второго раунда визуализации клетки могут быть зафиксированы и использованы для последующего иммунофлуоресцентного окрашивания. Это увеличивает количество измеряемых параметров на одних и тех же ячейках, а также позволяет ответить на дополнительные вопросы. После просмотра этого видео вы сможете проводить комбинированные измерения морфофункции АФК и митохондрий в адгезивных клеточных культурах с помощью микроскопии с высоким содержанием.