Визуализация окислительно-восстановительного состояния митохондрий в первичных нейронах с помощью ратиометрического индикатора

Возьмите покровную крышку с генетически модифицированными первичными нейронами в камере визуализации, заполненной буфером для визуализации.

Эти клетки экспрессируют окислительно-восстановительный индикатор на основе флуоресцентного белка в митохондриальном матриксе.

Поместите камеру под флуоресцентный микроскоп, определите клетки в видимом свете, затем переключитесь на флуоресцентную визуализацию.

Подайте две длины волны возбуждения для стимуляции индикатора и измерения флуоресцентного излучения.

Отношение интенсивности флуоресценции на этих длинах волн отражает степень окисления митохондрий.

Вводите NMDA для активации клеточных рецепторов NMDA, вызывая внутриклеточный приток кальция.

Увеличение вызывает поглощение кальция митохондриями, индуцируя выработку АФК и окисление митохондрий

.

АФК окисляет индикатор, изменяя его флуоресценцию и увеличивая коэффициент сигнала.

Вводите окислители для полного окисления индикатора, максимизируя коэффициент сигнала.

Удалите буфер, затем введите восстановители, чтобы полностью уменьшить краситель, минимизируя отношение сигнала.

Используйте максимальные и минимальные отношения сигналов для калибровки и количественного определения митохондриального окисления, вызванного NMDA.

Для создания изображений в реальном времени установите интервал интервальной съемки равным 30 секундам и продолжительность равной 25 минутам. Затем установите клетки, поместите камеру на микроскоп и сфокусируйте клетки, как показано ранее. Переключитесь в режим сканирования и используйте канал 488 нанометров в режиме реального времени для фокусировки и определения местоположения ячеек для визуализации. При необходимости, чтобы увеличить количество записываемых ячеек на прогон, используйте функцию многоточечной связи для отображения двух-трех полей обзора на каждом покровном листе.

Запустите съемку и запишите пять изображений в качестве двухминутной базовой записи. Добавьте в камеру 500 микролитров трехкратного раствора NMDA, чтобы достичь конечной концентрации 30 микромоляров, и запишите дополнительные 20 изображений в качестве 10-минутного отклика NMDA. Далее добавляем в камеру 500 микролитров четырехкратного раствора DA и записываем еще шесть снимков. Отберите буфер из камеры визуализации и замените его 1 миллилитром раствора DTT. После записи еще 10 изображений завершите запись и сохраните серию изображений.