Электрофизиологический анализ кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC-CMs) с использованием многоэлектродных массивов (MEAs)

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы диссоциировать кардиомиоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, и поместить их на многоэлектродные матрицы для измерения и количественной оценки продолжительности и частоты их типичного электрического сигнала, также называемого полевым потенциалом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в этой области, например, каковы электрофизиологические различия между кардиомиоцитами, несущими мутации, и контрольными группами. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить скрининг лекарственных препаратов на кардиомиоцитах человека, полученных из клеток пациента.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Поскольку этапы диссоциации и нанесения покрытия имеют важное значение для успешной регистрации электрических сигналов. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что идентификация электрических сигналов хорошего или плохого качества не является тривиальной, а анализ свободного потенциала требует опыта.

Для начала этой процедуры поместите чистую стружку в стандартную пластиковую стерильную чашку Петри диаметром 10 сантиметров. Далее добавьте в чашку Петри восемь миллилитров стерильной дистиллированной воды, чтобы образовалась увлажненная камера, которая предотвратит попадание небольшого объема питательной среды на чип при помещении в инкубатор. Затем используйте изготовленные на заказ кольца PolyTetraFluoroEthylene, чтобы обеспечить покрытие кардиомиоцитов в центре чипа, где находится электродная решетка.

В капюшоне культуры удаляют кольца от этанола. Поместите их в стерильную чашку Петри без крышки и дайте кольцам высохнуть в вытяжке. Затем поместите сухое кольцо внутрь чипа MEA с помощью пинцета, стерилизованного пламенем.

Покройте электроды, добавив 50 микролитров 40 микрограммов на миллилитр фибронектина внутрь кольца. После этого накройте чашку Петри крышкой и осторожно перенесите чашку, содержащую чип MEA, в инкубатор. После этого перенесите чашку, содержащую чип MEA, в колпак для клеточных культур.

Перед использованием чипа MEA необходимо аспирировать 50 микролитров фибронектина с помощью пипетки P200 или вакуумной системы в вытяжке, не смещая кольцо из ПТФЭ. Следите за тем, чтобы твердые предметы не касались электродов, удерживая наконечник под углом. Затем аккуратно добавьте 950 микролитров среды LI-BPEL, следя за тем, чтобы она равномерно распределилась и кольцо не всплыло.

Впоследствии верните блюдо в инкубатор. Это исходная культура бьющихся кардиомиоцитов. В вытяжке для культуры тканей хорошо аспирируйте среду из культуры hPSC-CMs.

Добавьте от одного до двух миллилитров PBS без кальция и магния в каждую лунку, чтобы промыть культуру и аспирировать PBS. После этого добавьте по 500 микролитров фермента диссоциации в каждую лунку. Инкубируйте образец в течение 5 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Через пять минут добавьте по одному миллилитру LI-BPEL в каждую лунку, чтобы разбавить фермент. Отсоедините монослой hPSC-CM, аккуратно поцарапав его пипеткой P1000. Затем соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров.

Затем промойте лунку одним миллилитром LI-BPEL, чтобы собрать все оставшиеся клетки и клеточные комки. Добавьте еще два-три миллилитра LI-BPEL, чтобы достичь конечного объема около пяти-шести миллиметров, и осторожно пипетируйте вверх и вниз три-пять раз пятимиллилитровой пипеткой, чтобы диссоциировать клеточные скопления. После этого центрифугируйте ячейки при комнатной температуре в течение трех минут при 300-кратном избежении.

После этого удалите надосадочную жидкость, не вытесняя клеточную гранулу. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 250 микролитрах LI-BPEL. Затем распределите 50 микролитров клеточной суспензии на каждую МЭА, поместив клеточную суспензию непосредственно в центр кольца из ПТФЭ в верхней части электродной матрицы.

Осторожно перенесите МЭА в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и дайте ячейкам прикрепиться на ночь. Через сутки после нанесения покрытия аккуратно извлеките кольцо в стерильную среду с помощью стерильного пинцета. Промойте кольцо в 80-процентном этаноле.

И храните его в 50-миллилитровой тубе, содержащей 80 процентов свежего этанола. Далее аккуратно извлеките 500 микролитров среды из микросхемы MEA. И добавляем в него 500 микролитров свежего LI-BPEL.

Это бьющиеся кардиомиоциты после удаления кольца. После этого перенесите MEA в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия. Затем измерьте электрическую активность hPSC-CM на MEA, начиная с одного дня после удаления кольца и до одной недели.

Теперь запустите пакет программного обеспечения, связанный с настройкой MEA. Затем установите температуру на 37 градусов Цельсия в TCX-Control, чтобы записать измерения. После этого достаньте из инкубатора тарелку, содержащую чип MEA.

Достаньте чип MEA из чашки и положите его на салфетку, чтобы впитать остатки воды. Тщательно протрите внешний слой пластины салфеткой и очистите его ватным тампоном, смоченным в 100-процентном этаноле, чтобы удалить остатки воды или мусора, которые могут вызывать сигнальный шум. Затем перенесите пластину MEA на регистрирующий головной столик с температурой 37 градусов Цельсия для обнаружения спонтанной активности.

Откройте MC Rack и нажмите кнопку «Редактировать», чтобы загрузить оборудование MEA. Чтобы создать новый протокол, используйте редактирование выпадающего меню, чтобы добавить в протокол другой регистратор и окна отображения. Впоследствии запустите протокол в режиме игры, нажав на кнопку воспроизведения.

Если сигналы демонстрируют видимые пики R и пики T, подождите от 10 до 15 минут, чтобы завершить фазу адаптации. Чтобы начать эксперимент, нажмите кнопку Запись, а затем воспроизведите и получите данные в течение 10 минут в базовых условиях, чтобы определить устойчивое состояние. Аннотируйте электроды с наилучшим сигналом, чтобы их можно было легко идентифицировать и экспортировать позже для анализа.

Для оценки реакции на лекарственное средство добавляйте увеличивающиеся концентрации препарата каждые 10 минут. Нажмите кнопку «Стоп», чтобы завершить запись в конце протокола. Вот репрезентативные трассы, записанные с MEA, показывающие хорошее качество трассировки с хорошо видимыми пиками RQ и T с высоким отношением сигнал/шум.

Трасса плохого качества без четко видимых пиков RQ и T И шумная трасса с хорошо видимыми пиками RQ и T, но с низким соотношением сигнал/шум. А вот репрезентативные примеры качественных полевых потенциальных трасс с различной морфологией, которые могут быть зарегистрированы во время экспериментов на MEA с использованием hPSC-CM. Затененная область представляет собой интервал QT, измеренный во время анализа.

Поскольку потенциал поля на MEA похож на первую производную потенциала действия, интеграл от следов потенциала поля был рассчитан как теоретическая демонстрация волн T, близких к полной реполяризации потенциала действия. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о выборе максимального количества электродов, чтобы обеспечить надежный и стабильный сигнал. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как квантовая ПЦР большеберцового времени или одноклеточный патч-зажим, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как специфическая экспрессия генов, связанная с электрическим фенотипом или специфическими плотностями ионного тока.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области стволовых клеток к изучению нарушений сердечного ритма и фармакологии in vitro с использованием кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как диссоциировать и помещать кардиомиоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, на MEA для электрофизиологических измерений и скрининга лекарств. Не стоит забывать, что работа с лекарственными препаратами может быть крайне опасной и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как стандартный GLP.