Одновременная изоляция высококачественных кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов от сердца взрослых крыс

Было разработано и описано несколько протоколов для изоляции различных типов сердечных клеток от сердца крысы. Здесь описан оптимизированный протокол, который позволяет изолировать высококачественные основные типы сердечных клеток (кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты) от одного препарата, что снижает затраты на эксперименты.

Общая цель этой процедуры заключается в одновременной изоляции жизнеспособных кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов из сердца крысы для их индивидуального анализа in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сердечно-сосудистой системы о сигнальных механизмах, участвующих в гипертрофии сердца, ишемическом реперфузионном повреждении, функции эндотелия и сердечном фиброзе. Основное преимущество этого метода заключается в том, что все основные клетки сердца могут быть выделены одновременно, что потенциально снижает связанные с этим затраты на исследования и количество экспериментальных животных.

После одной дистиллированной воды и одной 50-миллилитровой средней промывки Пауэлла замените среду 80 миллилитрами свежей среды Пауэлла и используйте стеклянную пипетку Пастера из стеклянного цилиндра для непрерывной конфузии среды карбогеном. Затем с помощью двух пар тонких изогнутых щипцов установите только что собранное сердце крысы через аорту на перфузионную систему Лангендорфа и поместите конец канюли перфузионной системы между первой ветвью аорты и аортальным клапаном. Зафиксируйте аорту с помощью зажима типа «крокодил

Откройте клапан канюли, а затем зафиксируйте сердце хирургическим швом. Дайте 35 миллилитровым средствам для перфузии пройти через сердце по каплям, удаляя остатки крови. Поместите сборную воронку под сердце и запустите перистальтический насос для рециркуляции перфузионной среды из сборной воронки в резервуар.

Добавьте раствор коллагеназы в перфузионную среду и перфузируйте сердце раствором рециркуляционной коллагеназы в течение 30 минут. В конце пищеварения с помощью ножниц извлеките сердце из системы Лангендорфа и поместите его в стеклянную чашку Петри. Теперь удалите предсердия и остатки жировой ткани из сердца.

Чтобы избежать загрязнения эпителиальных клеток, с помощью двух щипцов осторожно отшелушите перикард. Разрежьте сердце посередине и поместите половинки в измельчитель для ткани. Измельчите сердце два-три раза и перенесите кусочки ткани в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую 12 миллилитров буфера для пищеварения от перфузии Лангендорфа.

Переварите фрагменты ткани на водяной бане в течение пяти-10 минут, периодически перемешивая одноразовой пластиковой пипеткой объемом пять миллилитров. Затем процедите клеточную суспензию через сито 100 микрометров в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Промойте перфузионную систему минимум одним литром дистиллированной воды, а затем 100 миллилитрами 0,1 нормального гидроксида натрия в течение 30 минут, затем промойте систему еще двумя-тремя литрами дистиллированной воды и высушите аппарат промытым воздухом.

Соберите отфильтрованные клетки с помощью центрифугирования и с помощью одноразовой пипетки аккуратно перенесите эндотелиальные клетки и фибробластсодержащие надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 50 миллилитров. Суспендируйте гранулу в шести миллилитрах раствора кальция одного. Через одну минуту соберите клетки с помощью второго центрифугирования, и повторно суспендируйте гранулу в шести миллилитрах раствора кальция на два.

Через одну минуту разведите клеточную суспензию с добавлением 12 миллилитров раствора кальция на три, и хорошо перемешайте, аккуратно наклоняя. После очередного центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 20 миллилитрах предварительно подогретой среды CCT. Затем нанесите по одному миллилитру клеток на каждую из 20 стерильных 35-миллиметровых чашек для клеточных культур, предварительно покрытых ламинином, и поместите клетки в инкубатор для клеточных культур, свободных от углекислого газа, заменив среду двумя миллилитрами свежей среды CCT для удаления любых мертвых клеток через два часа.

Теперь центрифугируйте эндотелиальные клетки и фибробласты, содержащие надосадочную жидкость, и ресуспендируйте гранулу в 1,5 миллилитрах буфера для выделения эндотелиальных клеток. Перенесите клетки в двухмиллилитровую пробирку для образцов и добавьте в клетки антитела CD31 против крыс мыши для 30-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия с вращением из конца в конец. В конце инкубации добавьте шарики Pan anti-mouse IGG для инкубации 20 в инкубации при четырех градусах Цельсия, с вращением встык.

В конце инкубации шариков поместите клетки в магнитную стойку на две минуты и с помощью пипетки объемом в один миллилитр осторожно удалите в основном фибробласты, содержащую надосадочную жидкость. Посмотрите на фибробласты на 10-сантиметровой чашке для культивирования, содержащей 10 миллилитров среды для культивирования фибробластов, и поместите клетки в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на один час. Далее добавьте один миллилитр промывочного буфера в пробирку с эндотелиальными клетками и закупорьте пробирку.

Осторожно встряхните клетки четыре-пять раз, чтобы снова подвесить бусины. Затем верните трубку на магнит и через минуту снимите буфер для промывки. После последней промывки замените промывочный буфер одним миллилитром среды для культивирования эндотелиальных клеток MV2 и засейте эндотелиальные клетки в одну лунку 12-луночного планшета для их культивирования в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур.

По окончании инкубации фибробластов промойте прикрепленные клетки соответствующим объемом предварительно подогретого PBS два-три раза. Затем добавьте к клеткам предварительно подогретую свежую среду для клеточной культуры фибробластов и верните фибробласты в инкубатор для клеточных культур. На следующее утро замените надосадочную жидкость на культуре эндотелиальных клеток свежей средой для культуры эндотелиальных клеток и верните клетки в инкубатор, заменяя среду каждые два-три дня, до полуконфлигенции.

Затем промойте культуру прикрепленных клеток фибробластов свежей предварительно подогретой PBS, как показано выше, и накормите клетки свежей предварительно подогретой средой. Процедура выделения кардиомиоцитов дает от 70 до 80% чистой, жизнеспособной, палочковидной, поперечнополосатой популяции сердечных клеток. Затем может быть проведен внутриклеточный анализ кальциевых колебаний изолированных кардиомиоцитов, загруженных фура АМ, в ответ на репфузия ишемии в кардиомиоцитах, а также анализ изменений кальциевой сигнализации в изолированных эндотелиальных клетках и фибробластах магнитных шариков после добавления АТФ.

После освоения этой техники ее можно выполнить за три часа, если она выполнена правильно. Приступая к этой процедуре, важно помнить о правильной настройке этой системы перфузии и своевременно зафиксировать сердце в системе, как только оно будет готово. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области сердечно-сосудистых исследований для изучения сигналов, участвующих в различных сердечно-сосудистых патофизиологиях.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление об основных принципах выделения и культивирования сердечных клеток. Не забывайте, что работа с хирургическими инструментами и реагентами для клеточных культур может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как осторожное использование инструментов и использование перчаток.