Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Общей целью этого программного обеспечения для анализа изображений является параллельный анализ динамики выпячивания и относительной концентрации белка по всей длине филоподиала. Этот метод действительно может помочь нам понять ключевые вопросы клеточной биологии, особенно отдельные белки, участвующие в удлинении и втягивании филоподий. Основное преимущество методики заключается в том, что предоставленный алгоритм адаптивного отслеживания формы позволяет количественно оценить динамику выпячивания и локализацию белка с пространственным разрешением.

Для начала культивируйте нейроны, клетки HeLa или COS, в дополненной среде, как описано в текстовом протоколе. Как только конфлюенция будет достигнута на 40%, трансвектируйте клетки с помощью выбранных конструкций, используя трансвекционный реагент в соответствии с инструкциями производителя. Храните трансвекцированные клетки в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 15–18 часов.

После инкубации заполните камеры для клеточных культур до 90% предварительно нагретой средой с температурой 37 градусов Цельсия, содержащей 20 миллимоляров HEPES, чтобы уменьшить изменения pH и осмолярности из-за испарения во время получения изображения. Чтобы закрыть крышку, нанесите тонкий слой вакуумной смазки на внутреннюю сторону крышки и аккуратно прижмите ее к камере для культуры, содержащей трансвектированные клетки. Возможно, самой важной частью для анализа изображений является качество изображения.

Единственное, о чем мы должны заботиться, это соотношение сигнал/шум, которое должно быть больше четырех, и мы можем гарантировать, что, регулируя время экспозиции камеры, а также интенсивность и силу лазерного отслеживания, частота кадров должна составлять более одного герца. Получение изображений с помощью микроскопа с объективом 60x или 100x без изгиба пикселей. Используйте коэффициенты захвата не менее одного герца для отслеживания филоподиальной динамики.

Чтобы свести к минимуму артефакты вне фокуса, сделайте изображение филоподиального близко к мембране базилика. Чтобы обеспечить плавное отслеживание, отрегулируйте время экспозиции камеры и интенсивность лазера таким образом, чтобы отношение сигнал/шум было больше четырех. Как только это будет завершено, начните получение изображения.

После предварительной обработки изображений, как описано в текстовом протоколе, загрузите изображения, скачав заархивированную папку, содержащую все необходимые файлы для анализа изображений. Распакуйте и скопируйте файлы в рабочую папку. После установки запустите графический пользовательский интерфейс, открыв файл с именем filopodiaAnalysisM3.fig.

Загрузите сохраненные файлы стека TIFF для отдельных белков в графическом интерфейсе пользователя или графическом пользовательском интерфейсе. С помощью кнопок 1B для белка A, 1C для белка B и опционально, 1D для белка C. Создайте наложенное изображение клетки из белковых каналов, нажав 1A. Затем нажмите на 2A, чтобы назначить первый кадр, и нажмите на 2B, чтобы назначить последний кадр для анализа.

При необходимости обрежьте область интереса или ROI, содержащую интересующий филоподиум, с помощью кнопки 2H. Поверните изображение с помощью кнопки 2I или удалите ненужные области с помощью инструмента рисования 2J. Переместите ползунок на 2С для каждого кадра для контроля качества и проверки, остается ли филоподиум четко видимым на протяжении всего фильма.

Чтобы сгенерировать трассировку, сначала нажмите кнопку 3A в первом окне графического интерфейса, чтобы открыть второе окно графического интерфейса. Нажмите кнопку «четыре» во втором окне графического интерфейса, чтобы сгенерировать массу наложенного тела ячейки, которая была сгенерирована в первом окне графического интерфейса, после нажатия кнопки 1A. Мы рекомендуем потратить некоторое время на оптимизацию таких параметров, как количество сегментов, ширина сканирования и радиус сканирования для вашего экспериментального набора данных.

Переместите ползунок в окне номер два, чтобы проверить, где впервые появляется филоподиальный кончик. Затем нажмите пятую кнопку, и появится курсор. С помощью курсора выберите основание, от которого измеряется расстояние до филоподиального кончика.

Далее следует кончик филоподии в кадре, где он впервые появляется. Далее выберите пороговую длину, выше которой филоподия будет гнуться, используя 6С. Затем укажите количество сегментов, используемых для приближения формы филоподии в поле 6А.

Укажите ширину сканирования, которая действует как горизонтальный сканер, чтобы разместить узлы в 6B. Укажите радиус сканирования в поле 6D, используйте значение, которое примерно на 50% больше, чем наблюдаемое смещение межкадрового наконечника. Затем укажите угол изгиба в поле 6E.

Отметьте галочкой трассировку истории во втором окне графического интерфейса, чтобы сохранить весь протокол отслеживания для дальнейшего использования, а затем нажмите кнопку отслеживания и анализа, чтобы начать отслеживание. Для пространственно-временного анализа выберите прямоугольник, представленный цифрой 8B, за которой следует интересующий вас белковый канал. Нажмите на 8А, чтобы начать отслеживание белка по длине филоподиа, используя ранее сгенерированную кривую.

Для ратиометрического анализа белка установите флажок 9B или 9C и нажмите на кнопку 9A, чтобы получить пространственно-временной ратометрический график. Чтобы выполнить филоподиальный анализ кончика, установите флажок 8F и укажите длину зонда и пороговую длину от основания с помощью 8G и 8H. Нажмите на кнопку, чтобы сохранить данные в файл Excel с именем dynamics.xlsx.

Затем нажмите «Анализировать интенсивность белка», чтобы получить след интенсивности белка на филоподиальном кончике и сохранить для ратиометрического анализа. Нажмите на нужное соотношение для анализа, используя 9D или 9E. Наконец, нажмите кнопку сравнения, 9A, чтобы сгенерировать ратиометрические данные.

Анализ клеток COS, трансвекцированных маркером нитевидного актина красным цветом и цитозольным эталоном зеленым, выявил богатые актином филоподиальные выступы. Временной ряд показывает, что богатые актином филоподиальные выступы быстро расширяются и втягиваются. С помощью программного обеспечения для анализа изображений были прослежены отдельные филоподии.

Программное обеспечение для анализа изображений надежно отслеживает распространение филоподий, в дополнение к скорости роста и ретракции отдельного филоподия, хемиграфы также отображают концентрацию актина, нормализованную к цитозольному референсу. При правильном использовании этот метод позволяет количественно анализировать динамику выступов и пространственно разрешенную концентрацию белка вдоль филоподии. При попытке проведения процедуры важно помнить о скорости захвата и поддерживать соотношение сигнал/шум больше четырех, при этом не перегружая отдельные изображения.