Визуализация взаимодействий белок-ДНК в живых бактериальных клеток с использованием отслеживания одиночных молекул фотоактивируемые

Общая цель этой процедуры заключается в непосредственной визуализации и количественной оценке активности ДНК-связывающих белков в живых бактериальных клетках. Это достигается путем визуализации клеток, которые экспрессируют фотоактивированный флуоресцентный белок, слитый с представляющим интерес белком, связывающим ДНК. Вторым этапом процедуры является получение изображения отдельных белков, которые активируются во время визуализации.

Затем данные анализируются для определения локализации белков и отслеживания белков внутри отдельных клеток. События связывания ДНК идентифицируются по изменению коэффициента диффузии отдельных белков при их контакте с хромосомами. В конечном счете, полученные результаты могут обеспечить количественное измерение взаимодействий белковой ДНК на уровне одной клетки путем подсчета количества связанных и диффундирующих белков на клетку.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репарации ДНК, такие как скорость репарации in vivo и пространственное распределение сайтов репарации. Теперь мы продемонстрируем метод, измерив активность репарации ДНК-полимеразы одного в жизни клетки кишечной палочки: сначала изготовим покровные стекла без фоновых флуоресцентных частиц в печи при температуре 500 градусов Цельсия в течение часа. Сожгите в запасе покровные листы толщиной 1,5, храните их при комнатной температуре в алюминиевой фольге.

Они хороши на несколько недель вперед. Затем сконцентрируйте миллилитр кишечной палочки ранней экспоненциальной фазы в микроцентрифужной пробирке штамма объемом 1,5 миллилитров. AB 1157 поли а ПА м вишня центрифугирует клетки при 2 300 G в течение пяти минут.

Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 20 микролитрах остаточной среды и переведите клетки в раствор. Затем приготовьте раствор с низкой флуоресценцией 1,5% в дистиллированной воде. Смешайте 500 микролитров расплавленных аэродинамиков с 500 микролитрами двух минимальных сред, осторожно пипетируя вверх и вниз несколько раз для экспериментов по повреждению ДНК с использованием метилметансульфоната или MMS, соблюдая меры предосторожности.

Добавьте 8,3 микролитра MMS к 500 микролитрам минимальной среды перед тем, как смешать ее с аросом, прежде чем смесь остынет. Разложите его на обожженной крышке листом. Распределите его равномерно и по центру, не образуя пузырей.

Разровняйте прокладку со вторым обожженным чехлом. После остывания снимите верхнюю крышку с прокладки и добавьте микролитр концентрированной клеточной суспензии. Обездвижите ячейки, накрыв прокладку новым обожженным покровным листом и очень осторожно придавив вниз.

Клетки должны быть визуализированы в течение 45 минут до их высыхания. Чтобы продлить это время, прокладка может быть запечатана внутри силиконовой прокладки для экспериментов по повреждению ДНК. Перед визуализацией клетки инкубируйте их на подушечке в течение 20 минут.

В увлажненном контейнере при комнатной температуре микроскоп оснащен 405-нанометровым фотоактивационным лазером и 561-нанометровым лазером возбуждения. Чувствительность к одной молекуле достигается за счет возбуждения только флюорочетверов в тонком сечении над поверхностью скольжения покрова с использованием сильно наклоненного освещения, флуоресцентное излучение регистрируется на ПЗС-камере, умножающей электроны. Поместите образец на предметный столик микроскопа и сфокусируйте клетки.

При освещении проходящим светом задайте обрезанное поле зрения, чтобы уменьшить размер данных и увеличить скорость считывания данных камерой. Закройте образец от окружающего света и включите усилитель ПЗС-камеры, умножающий электроны, для обнаружения одного флюоро-4. Установите частоту кадров равной 15,26 миллисекунд на кадр.

Это включает в себя 0,26 миллисекунды считывания камеры Время экспозиции должно быть достаточно коротким, чтобы можно было наблюдать резкие флуоресцентные пятна с небольшим количеством вспышек движения. С другой стороны, треки должны быть отобраны через достаточно длительные промежутки времени, чтобы четко отличить связанные молекулы от диффундирующих. Теперь отобразите данные камеры, чтобы проверить сигнал темного фона.

Включите лазер с яркостью 561 нанометр и проверьте сигнал фона возбуждения. Включите 405-нанометровый лазер для фотоактивации белков вишни Paul one PA M и увеличивайте интенсивность до появления флуоресцентных пятен отдельных молекул. Теперь отрегулируйте угол луча возбуждения так, чтобы он освещал только тонкий участок образца.

Закройте поверхность скольжения крышки. Этот метод основан на обнаружении и точной локализации одиночных флуоресцентных белков, поэтому оптимальное выравнивание и чувствительность микроскопа будут иметь решающее значение для качества данных. Для этого сфокусируйте лазерный луч в задней фокальной плоскости объектива с числовой апертурой 100 x 1,4.

Перемещение фокусирующей линзы перпендикулярно лучу перемещает фокус от центра объектива, в результате чего луч выходит из объектива под углом. Стремитесь к тому, чтобы луч максимизировал интенсивность флуоресценции и минимизировал фон. Найдите новое поле зрения клеток в режиме микроскопии в проходящем свете и сфокусируйте изображение.

Сделайте снимок камеры, чтобы записать контуры ячеек. Включите лазер с яркостью 561 нанометр и обесцвечьте клеточную автофлуоресценцию и фоновые пятна на крышке. Поскользните несколько секунд.

Прежде чем начать сбор данных, начните сбор пленки ладони при непрерывном возбуждении 561 нанометров. Включите 405-нанометровый лазер и постепенно увеличивайте интенсивность в течение фильма, достигая одного ватта на квадратный сантиметр. Избегайте более высоких интенсивностей 405 нанометров, которые вызывают клеточную автофлуоресценцию.

Обратите внимание на плотность флуоресцентных молекул. Важно поддерживать низкую скорость активации, чтобы флуоресцентные пятна были четко изолированы в каждом кадре. Записывайте около 10 000 кадров на фильм, что с обрезанным полем зрения обычно занимает до трех минут и до гигабайта места на жестком диске.

Обратите внимание, что после того, как поле зрения было получено изображение, флуорофоры вишни необратимо обесцвечиваются и их невозможно наблюдать. Опять же, следующая процедура использует пользовательское программное обеспечение в matlab. Одиночные флуорофоры проявляются в виде функций рассеяния точки или PSFS.

В фильме PSFS впервые идентифицируются в полосовом фильтрованном изображении с использованием гауссова ядра с диаметром семь пикселей, а потенциальные позиции соответствуют P SFS с пиковой интенсивностью пикселей в 4,5 раза выше стандартного отклонения фона. Локально самый яркий пиксель для каждого кандидата в PSF служит начальным предположением для подгонки эллиптической гауссовской функции. Параметрами свободной аппроксимации являются положение по оси X y, положение по ширине X, поворот по оси Y, угол, амплитуда и смещение фона.

Эллиптическая гауссова маска отвечает за движение молекул во время экспозиции, что размывает и деформирует график PSF. Результирующие XY-локализации со всех кадров фильма на ладони на проходящем световом микроскопическом изображении того же поля зрения локализаций Павла и PAM Cherry должны появиться в центральной области клеток кишечной палочки. Автоматизированное отслеживание измеряет движение белков, но удачный выбор окна отслеживания имеет решающее значение.

Во-первых, запустите алгоритм отслеживания для ряда параметров окна отслеживания. Постройте график количества измеренных дорожек на ячейку относительно окна отслеживания, чтобы определить минимально возможное окно отслеживания, которое не разделяет дорожки, отобразить результирующие дорожки на изображении микроскопии проходящего света в том же поле зрения. Чтобы визуализировать пространственное распределение движения молекул в клетках, треки P one должны демонстрировать диффузию, ограниченную отдельными клетками, если часть треков пересекается между клетками, это говорит о том, что отдельные молекулы были ошибочно связаны из-за слишком большого окна отслеживания или слишком высокой скорости фотоактивации.

Построение графика совокупного распределения длин шагов между последовательными локализациями. Кривая поднимается вверх и плавно насыщается для достаточно больших окон слежения, но показывает край среза, если окно было выбрано слишком маленьким. После того, как выбрано подходящее окно слежения, можно проанализировать диффузионные характеристики Paul one.

Вычислите среднее квадратичное смещение или MSD между последовательными локализациями для каждой дорожки с общим количеством n шагов, используйте только дорожки с не менее чем пятью локализациями, чтобы уменьшить статистическую неопределенность MSD. Затем рассчитайте коэффициент кажущейся диффузии для каждой дорожки из MSD. Второй член корректирует предполагаемую ошибку локализации.

Это значения для второго члена. В этом примере теперь построим гистограмму измеренных значений коэффициента диффузии по всем дорожкам в поле зрения для pol one в неповрежденных клетках и для pol one в клетках, находящихся под лечением повреждения ДНК с помощью MMS, красные столбцы идентифицируют популяцию отдельных молекул pol one, которые кажутся связанными с хромосомой и диффундируют со скоростью менее 0,15 квадратных микрон в секунду. В то время как свободно диффундирующие молекулы движутся со скоростью около 0,9 квадратных микрон в секунду.

После связывания Пола была идентифицирована одна молекула. Положение сайтов связывания может быть визуализировано как в неповрежденных клетках, так и в клетках с миллиметровым повреждением МС. Доля связанных треков по отношению к общему числу наблюдаемых треков обеспечивает прямое количественное измерение активности репарации ДНК pol.

В живых клетках кишечной палочки была проведена одна фотоактивация белков слияния pol one PA m cherry in vivo. Фотоактивация может быть ограничена одним флуорофором вишни PA m в одной клетке, более высокая скорость фотоактивации выявляет большее количество флуоресцентных молекул. Анализ локализации проводился для каждого кадра фильма на ладони.

Точность была измерена с использованием неподвижных молекул в неподвижных клетках или связанных молекул в живых клетках, и оказалось, что она составляет 40 нанометров, что согласуется с теоретическим предсказанием. Далее порог локализации устанавливался, когда он был слишком низким. Случайные пики в фоновом шуме ошибочно выбирались в качестве потенциальных позиций, тогда как если порог был слишком высоким, некоторые места пропускались.

Полученная локализация Пола занимала центральную область клетки, в общих чертах повторяя пространственную организацию нуклеоида кишечной палочки. Большинство следов Paul One в неповрежденных клетках проявляют диффузию. Типичная клетка содержит несколько сотен половых дорожек, что согласуется с числом копий примерно 400 молекул Paul One на клетку кишечной палочки.

Различные типы молекулярного движения могут быть идентифицированы путем вычисления значений MSD в диапазоне запаздывания: направленное движение дает параболическую кривую. Броуновское движение характеризуется прямой линией. Замкнутая кривая диффузии достигает плато, а смещение кривой MSD для неподвижных частиц представляет неопределенность локализации.

Результирующая кривая MSD для единицы Пола линейно повышалась в течение коротких времен запаздывания, указывающих на броуновское движение, и насыщалась при более длительных временах запаздывания из-за удержания клеток. С помощью этих методов была измерена активность репарации ДНК Пола в ответ на экзогенное повреждение ДНК алкилированием в неповрежденных клетках. Гистограмма коэффициента диффузии Paul One показывает доминирующую популяцию диффундирующих молекул.

Несколько связанных молекул могут быть вовлечены в репликацию ДНК и репарацию эндогенных повреждений ДНК при непрерывном 100-миллимолярном повреждении MMS. Частота треков с близкими к нулю коэффициентами диффузии значительно увеличивается. Это подтверждает модель, согласно которой большее количество молекул должно быть вовлечено в репарацию ДНК с присутствующим мутагеном после этой процедуры.

Другие методы анализа данных, такие как локализация, кластеризация, могут быть выполнены для количественной оценки пространственного распределения белков в клетке и для исследования присутствия более крупных белковых комплексов, участвующих в репарации ДНК.