Визуализация взаимодействий белок-ДНК в живых бактериальных клеток с использованием отслеживания одиночных молекул фотоактивируемые

Общая цель данной процедуры заключается в прямой визуализации и количественной оценке активности ДНК-связывающих белков в живых бактериальных клетках. Это достигается путем визуализации клеток, экспрессирующих фотоактивируемый флуоресцентный белок, слитый с интересующим ДНК-связывающим белком. Вторым этапом процедуры является запись видеоролика, на котором фиксируется фотоактивация отдельных белков непосредственно в процессе получения изображений.

Затем проводится анализ данных для определения локализации белков и отслеживания их перемещения внутри отдельных клеток. События связывания с ДНК идентифицируются по изменению коэффициента диффузии отдельных белков при их контакте с хромосомами. В конечном итоге полученные результаты позволяют количественно оценить взаимодействия белков с ДНК на уровне единичных клеток путем подсчета количества связанных и диффундирующих белков в каждой клетке.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области репарации ДНК, такие как скорость репарации in vivo и пространственное распределение сайтов репарации. Сейчас мы продемонстрируем этот метод, измерив активность репарации ДНК-полимеразы I в живых клетках e coli. Сначала прокалите покровные стекла, не содержащие фоновых флуоресцентных частиц, в печи при 500 °C в течение одного часа. Прокалите запас покровных стекол толщиной № 1,5 и храните их при комнатной температуре в алюминиевой фольге.

Они будут пригодны для использования в течение нескольких недель. Затем сконцентрируйте 1 мл культуры E coli штамма AB 1157 poly a PA m cherry в фазе раннего экспоненциального роста в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Центрифугируйте клетки при 2 300 G в течение пяти минут.

Удалите супернандат и ресуспендируйте осадок клеток в 20 µL остаточной среды, затем перемешайте клетки на вортексе до полного растворения. Далее приготовьте 1,5% раствор арос с низкой флуоресценцией в дистиллированной воде. Для экспериментов по повреждению ДНК с использованием метилметансульфоната или MMS, соблюдая меры предосторожности, смешайте 500 µL расплавленного арос с 500 µL двухкратной минимальной среды, осторожно перемешивая содержимое дозатором путем нескольких подъемов и спусков жидкости.

Добавьте 8,3 µL MMS к 500 µL минимальной среды перед смешиванием с aros, пока смесь не остыла. Распределите её по прокаленному покровному стеклу. Распределите раствор равномерно по центру, избегая образования пузырьков.

Разгладьте слой с помощью второго прокаленного покровного стекла. После охлаждения снимите верхнее стекло с площадки и добавьте один микролит концентрированной клеточной суспензии. Иммобилизуйте клетки, накрыв площадку новым прокаленным покровным стеклом и очень осторожно нажав на него.

Визуализацию клеток следует провести в течение 45 минут, прежде чем они высохнут. Чтобы увеличить это время, при проведении экспериментов по повреждению ДНК прокладку можно загерметизировать с помощью силиконовой прокладки. Перед началом визуализации инкубируйте клетки на прокладке в течение 20 минут.

В увлажненном контейнере при комнатной температуре микроскоп оснащен лазером для фотоактивации с длиной волны 405 нм и возбуждающим лазером с длиной волны 561 нм. Чувствительность на уровне единичных молекул достигается путем возбуждения флуорофоров только в тонком слое над поверхностью покровного стекла с использованием освещения под большим углом; эмиссионная флуоресценция регистрируется с помощью CCD-камеры с электронным умножением. Поместите образец на предметный столик микроскопа и сфокусируйте изображение клеток.

При освещении проходящим светом определите ограниченную область обзора (cropped field of view), чтобы уменьшить объем данных и увеличить скорость считывания камеры. Защитите образец от внешнего света и включите усиление электронно-умножающей ПЗС-камеры для детектирования одного флуорофора. Установите частоту кадров на 15.26 milliseconds на кадр.

Сюда входит время считывания камеры, составляющее 0.26 миллисекунд. Время экспозиции должно быть достаточно коротким, чтобы наблюдать четкие флуоресцентные пятна с минимальным размытием при движении. С другой стороны, интервалы между выборками траекторий должны быть достаточно длительными, чтобы четко отличить связанные молекулы от диффундирующих. Теперь отобразите данные с камеры, чтобы проверить сигнал темного фона.

Включите лазер с длиной волны 561 нм и проверьте фоновый сигнал возбуждения. Включите лазер с длиной волны 405 нм для фотоактивации слитых белков Paul one PA M cherry и увеличивайте интенсивность до появления флуоресцирующих пятен отдельных молекул. Теперь отрегулируйте угол луча возбуждения так, чтобы освещался только тонкий срез образца.

Накройте поверхность покровного стекла. Данный метод основан на детектировании и точном определении локализации одиночных флуоресцентных белков, поэтому для обеспечения качества данных критически важны оптимальная юстировка и чувствительность микроскопа. Для этого сфокусируйте лазерный луч в задней фокальной плоскости объектива 100 x с числовой апертурой 1.4.

Смещение фокусирующей линзы перпендикулярно пучку смещает фокус относительно центра объектива, в результате чего пучок выходит из объектива под углом. Отрегулируйте положение пучка таким образом, чтобы максимизировать интенсивность флуоресценции и минимизировать фоновый сигнал. Найдите новое поле зрения с клетками в режиме микроскопии в проходящем свете и сфокусируйте изображение.

Сделайте снимок камерой, чтобы зафиксировать контуры клеток. Включите лазер с длиной волны 561 нанометр и выбелите клеточную автофлуоресценцию и фоновые пятна на предметном стекле в течение нескольких секунд.

Перед началом сбора данных запустите запись PALM-видео при непрерывном возбуждении длиной волны 561 нм. Включите лазер с длиной волны 405 нм и постепенно увеличивайте его интенсивность в течение записи до 1 Вт/см². Избегайте более высоких значений интенсивности лазера 405 нм, которые вызывают клеточную автофлуоресценцию.

Обратите внимание на плотность флуоресцентных молекул. Важно поддерживать низкую скорость активации, чтобы флуоресцентные пятна были четко изолированы в каждом кадре. Запишите около 10 000 кадров для каждого видеоролика; при обрезанном поле зрения это обычно занимает до трех минут и до одного гигабайта места на жестком диске.

Обратите внимание, что после получения изображения поля зрения флуорофоры pa m cherry необратимо выгорают и более не могут быть обнаружены. Напоминаем, что в данной процедуре используется специализированное программное обеспечение в matlab. Одиночные флуорофоры выглядят как функции распространения точки или psf.

В видеоролике psf сначала идентифицируются на изображении с полосовой фильтрацией с использованием гауссовского ядра диаметром семь пикселей; позиции кандидатов соответствуют P SFS с пиковыми значениями интенсивности пикселей, превышающими стандартное отклонение фона в 4,5 раза. Локально самый яркий пиксель для каждого кандидата PSF служит начальным приближением для аппроксимации эллиптической функции Гаусса. Свободными параметрами аппроксимации являются позиция X, позиция Y, ширина X, ширина Y, угол поворота, амплитуда и смещение фона.

Эллиптическая гауссова маска учитывает перемещение молекул во время экспозиции, что приводит к размытию и деформации графика PSF. Полученные XY-локализации из всех кадров видео PALM, наложенные на изображение просвечивающей микроскопии того же поля зрения, должны показывать, что локализации mPalm-Cherry находятся в центральной области клеток E. coli. Автоматизированный трекинг позволяет измерить перемещение белков, однако решающее значение имеет правильный выбор окна трекинга.

Сначала запустите алгоритм трекинга для диапазона параметров окна трекинга. Постройте график зависимости количества измеренных треков на клетку от размера окна трекинга, чтобы определить минимально возможное окно, при котором треки не разделяются; отобразите полученные треки на изображении того же поля зрения, полученного с помощью микроскопии в проходящем свете. Для визуализации пространственного распределения перемещения молекул внутри клеток треки должны демонстрировать диффузию, ограниченную пределами отдельных клеток; если часть треков пересекает границы клеток, это указывает на то, что отдельные молекулы были ошибочно связаны из-за слишком большого окна трекинга и/или слишком высокой скорости фотоактивации.

Постройте график кумулятивного распределения длин шагов между последовательными локализациями. Кривая плавно поднимается и выходит на плато при достаточно больших окнах трекинга, но имеет резкий обрыв, если окно было выбрано слишком малым. После выбора подходящего окна трекинга можно приступить к анализу характеристик диффузии Paul one.

Вычислите среднеквадратичное смещение (MSD) между последовательными локализациями для каждого трека с общим количеством n шагов; для снижения статистической неопределенности MSD используйте только треки, содержащие не менее пяти локализаций. Затем на основе MSD рассчитайте кажущийся коэффициент диффузии для каждого трека. Второе слагаемое вносит поправку на расчетную ошибку локализации.

Это значения для второго члена. В данном примере постройте теперь гистограмму измеренных значений коэффициента диффузии для всех треков в поле зрения для pol one в неповрежденных клетках и для pol one в клетках, подвергнутых воздействию MMS для повреждения ДНК; красные столбцы определяют популяцию отдельных молекул pol one, которые, по-видимому, связаны с хромосомой и диффундируют со скоростью менее 0.15 square microns per second. В то время как свободно диффундирующие молекулы перемещаются со скоростью около 0.9 square microns per second.

После идентификации связанных молекул полимеразы 1. Положения сайтов связывания можно визуализировать в неповрежденных клетках и в клетках с повреждениями, вызванными mm MS. Доля связанных треков относительно общего числа наблюдаемых треков обеспечивает прямое количественное измерение активности репарации ДНК полимеразой.

Фотоактивация in vivo слиянных белков pol one PA m cherry была проведена в живых клетках e coli. Фотоактивация могла быть ограничена одним флуорофором PA m cherry в одной клетке; при более высоких скоростях фотоактивации выявлялось большее количество флуоресцентных молекул. Анализ локализации выполнялся для каждого кадра PALM-видео.

Точность измеряли с помощью неподвижных молекул в фиксированных клетках или связанных молекул в живых клетках; она составила 40 nanometers, что согласуется с теоретическим прогнозом. Затем был установлен порог локализации, так как при слишком низком значении случайные пики фонового шума ошибочно выбирались в качестве потенциальных координат, в то время как при слишком высоком пороге некоторые пятна пропускались.

Полученные локализации Paul one занимали центральную область клетки, в целом повторяя пространственную организацию нуклеоида e coli. Большинство треков Paul one в неповрежденных клетках характеризуются диффузией. Типичная клетка содержит несколько сотен треков Paul one, что соответствует числу копий примерно 400 молекул Paul one на одну клетку e coli.

Различные типы молекулярного движения можно определить путем расчета значений MSD в диапазоне временных задержек: направленное движение дает параболическую кривую. Броуновское движение характеризуется прямой линией. Кривая ограниченной диффузии достигает плато, а смещение кривой MSD для неподвижных частиц представляет неопределенность локализации.

Полученная кривая MSD для Paul one линейно возрастала при коротких временах задержки, что указывает на броуновское движение, и выходила на плато при более длительных временах задержки из-за ограничения пространства клеткой. С помощью этих методов была измерена активность репарации ДНК Paul one в ответ на экзогенное алкилирующее повреждение ДНК в неповрежденных клетках. Гистограмма коэффициентов диффузии Paul one демонстрирует доминирующую популяцию диффундирующих молекул.

Небольшое количество связанных молекул могут участвовать в репликации ДНК и восстановлении эндогенных повреждений ДНК при непрерывном воздействии 100 мМ MMS. Частота траекторий с коэффициентами диффузии, близкими к нулю, значительно возрастает. Это подтверждает модель, согласно которой при наличии мутагена в процессе восстановления ДНК должны быть задействованы более одной молекулы Paul после выполнения данной процедуры.

Для количественной оценки пространственного распределения белков в клетке и исследования наличия более крупных белковых комплексов, участвующих в репарации ДНК, могут быть применены другие методы анализа данных, такие как локализация и кластеризация.