Протокол дифференцирования индуцированных человеком стволовых клеток с плюрипотентными клетками в смешанные культуры нейронов и глии для тестирования нейротоксичности

Общая цель этой процедуры заключается в дифференцировке нейральных стволовых клеток, полученных из индуцированных нами колоний плюрипотентных стволовых клеток человека, в смешанные культуры нейронных и глиальных клеток. Эта модель подходит для скрининга токсичности лекарственных препаратов и химических веществ. Эта модель in vitro может быть применена для оценки химических возмущений сигнальных путей, которые активируются в процессе нейрональной и глиальной дифференцировки.

Основным преимуществом данной системы является использование человеческой модели, полученной из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которая представляет собой альтернативу традиционно используемым раковым клеткам и первичным культурам животных и позволяет изучать нейротоксичность в смешанной популяции нейрональных и глиальных клеток. Процедуру продемонстрируют Франческа Пистоллато, наш постдок, и Каролина Нуньес, аспирант нашей лаборатории. Начните с обхода колоний HiPSC.

Работая под стереоскопическим микроскопом с четырехкратным увеличением в ламинарном шкафу, используйте одномиллилитровый шприц с иглой 30 калибра. Разрежьте колонии стволовых клеток на квадраты размером примерно 200 микрон на 200 микрон. Вырезание колоний требует хороших навыков ручного труда для получения фрагментов одинакового размера.

В этом может помочь использование коммерчески доступных режущих инструментов. Затем с помощью пипетки объемом 200 микролитров отделите фрагменты колонии от поверхности чашки, осторожно пипетируя нижнюю среду, чтобы приподнять кусочки. Перенесите около 100 фрагментов колонии в квалифицированную матричную 60-миллиметровую чашку с покрытием DMEM F12, заполненную четырьмя миллилитрами полной среды hiPSC.

Затем инкубируйте новую чашку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Выполняйте полную смену среды каждый день и изучайте морфологию колоний с помощью фазово-контрастного микроскопа с четырехкратным и 10-кратным увеличением. В нулевой день процедуры дифференцировки освежите среду hiPSC, добавив три миллилитра среды на 60-миллиметровую чашку Петри.

Затем разрежьте и отделите фрагменты размером 200 микрон, как и раньше. Пипеткой отсоедините отколовшиеся фрагменты и среду в 15-миллилитровую пробирку. Промойте посуду двумя миллилитрами полной среды ИПСК и восстановите все осколки.

Затем центрифугируйте при 112 перегрузках в течение одной минуты. После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте фрагменты в пяти миллилитрах полной среды hiPSC EB. Поместите весь объем в 60-миллиметровую чашку для культивирования тканей со сверхнизким уровнем прикрепления.

Инкубируйте блюдо в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день проверьте клетки с помощью инвертированного микроскопа. В тот день эмбриональные тельца должны казаться округлыми и отличными друг от друга, как показано здесь.

Затем пипеткой измельчите тельца и среду из чашки и переложите в пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте эмбриоидные тельца при 112 перегрузках в течение одной минуты. На второй день аспирируйте стандартный матричный раствор покрытия из заранее приготовленной 60-миллиметровой чашки и добавьте в чашку пять миллилитров полной нейроэпителиальной индукционной среды, или NRI.

Работая под стереоскопическим микроскопом при четырехкратном увеличении и используя пипетку объемом 200 микролитров, соберите около 50 плавающих эмбриоидных тел и перенесите их в одну покрытую покрытием чашку. Затем инкубируйте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день, на третий день процедуры дифференцировки, проверьте чашку под микроскопом при 10-кратном увеличении, чтобы убедиться, что все эмбриоидные тельца прикреплены.

Затем аккуратно выполните полную смену среды с помощью полной среды NRI. Меняйте среду NRI через день до седьмого дня, когда должны быть видны розеткообразные нейроэпителиальные агрегаты. На седьмой день покройте 96-луночный планшет, набрав в каждую лунку 100 микролитров стандартной матрицы, разведенной в питательной среде.

На восьмой день разрежьте розеткообразные агрегаты на фрагменты под стереоскопическим микроскопом при 10-кратном увеличении в стерильных условиях. Обратите внимание, что розетки имеют свойство легко отделяться от блюда при прикосновении иглой. В этом случае частично разложите оторвавшуюся розетку кончиком иглы.

Если розетки останутся частично прикрепленными, используйте пипетку объемом 200 микролитров, чтобы завершить отслоение фрагментов розетки. Обрезка розеткой требует хороших навыков ручного труда и точности, чтобы избежать разрезания без производных нейрексидермальных продуктов. Далее соберите фрагменты розетки и их среду в коническую трубку объемом 15 миллилитров

Промойте посуду двумя миллилитрами среды NRI, чтобы восстановить все осколки. Затем раскрутите осколки розетки со скоростью 112 G в течение одной или двух минут. После аспирации надосадочной жидкости аккуратно ресуспендировать гранулу в одном миллилитре предварительно подогретого X DPBS без кальция и магния.

Аккуратно пипетируйте фрагменты розетки вверх и вниз, чтобы частично диссоциировать их. Затем добавьте четыре миллилитра полной среды NRI и подсчитайте клетки с помощью трипанового синего и автоматического счетчика клеток. Затем отсасывайте стандартный раствор матричного покрытия из 96-луночного планшета и наносите ячейки в лунки с плотностью около 15 000 ячеек на квадратный сантиметр в среде NRI.

Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе. На 10-й день проведите полное изменение среды с использованием среды полной дифференцировки нейронов. На этом репрезентативном изображении показаны розетки после 12 дней in vitro, окрашенные на нестин в зеленый цвет и бета-три тубулин в красный цвет.

Здесь клетки, которые выращивались в течение 28 дней in vitro, были окрашены на бета-3 тубулин в красный цвет и NF200 в зеленый. На этом репрезентативном изображении показаны нейрональные клетки, дифференцированные от НСК через 21 день in vitro, окрашенные на NF200 в красный цвет и жгут в зеленый. Здесь глиальные клетки из той же культуры окрашиваются на GFAP в красный цвет.

На этой гистограмме сравнивается количественное определение нестина, MAP 2, GFAP, гамма-аминомасляной кислоты, везикулярного транспортера глутамата 1 и тирозингидроксилазы положительных клеток в производных IMR90 hiPSC и клетках, дифференцированных из НСК, полученных из IMR90 hiPSC. Эти фазово-контрастные изображения, полученные с использованием объектива 10X, показывают, что нейрональные стволовые клетки подвергаются дифференцировке в течение 21 дня. Следуя этим процедурам, можно выполнять другие считывания, такие как количественная ПЦР в реальном времени и многосторонний повторный анализ, чтобы оценить физиологию и фенотип нейрональных и глиальных клеток, а также оценить влияние химических веществ.

Не забывайте, что работа с химическими соединениями может быть крайне опасной. Вот почему соответствующие меры предосторожности всегда должны приниматься с использованием защитных очков, перчаток или маски под капюшоном, особенно при выполнении химической обработки. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить смешанную дифференцированную популяцию нейронов и глиальных клеток, начиная с индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, которые представляют собой подходящую модель, in vitro, для разработки по тестированию нейротоксичности.