Трехмерная Количественное дендритных шипиков пирамидальных нейронов из производных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель данной процедуры заключается в получении изображений дендритных шипиков нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, и их количественном анализе в трех измерениях. Для этого сначала покровные стекла в шестилуночных планшетах обрабатывают полиуретаном и ламинином для культивирования нейральных стволовых клеток. Затем нейральные стволовые клетки разводят в культуральной среде.

Среду распределяют по планшетам, используя плавные вращательные движения пипетки, и оставляют для дифференцировки в культуре на срок до 70 дней. После регулярного обновления среды клетки трансдуцируют лентивирусом GFP, окрашивают антителами к GFP и визуализируют. В завершение культуры фиксируют, а дендритные шипики исследуют с помощью конфокальной микроскопии.

В конечном итоге данные изображений дендритных шипиков человека реконструируются в 3D для их классификации и количественного анализа. Данный протокол представляет собой пошаговую процедуру получения глутаматергических нейронов второго-четвертого слоев коры головного мозга человека. Метод основан на использовании нейральных стволовых клеток, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, которые, в свою очередь, были получены из фибробластов человека согласно ранее опубликованному методу.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими является возможность автоматической трехмерной сегментации DON right и PY. Это обеспечивает значительную экономию времени по сравнению с существующим программным обеспечением, которое обычно позволяет проводить только 2D-анализ. Классификации donr и spy также очень удобны и просты в использовании.

Для подготовки нейрональных культур поместите стеклянные покровные стекла в шестилуночные культуральные планшеты, добавьте полиорнитин и инкубируйте в ламинарном шкафу в течение ночи. На следующий день трижды промойте покровные стекла раствором DPBS, добавьте ламинин и инкубируйте в ламинарном шкафу не менее 10 часов. Приготовьте культуральную среду, содержащую следующие компоненты.

Затем используйте среду для посева и распределения нейральных стволовых клеток (NSCs) с плотностью 50 000 клеток на квадратный сантиметр, используя медленные вращательные движения при пипетировании для уменьшения агрегации клеток, чтобы трансдуцировать нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) человека. На любом этапе созревания добавьте в каждую лунку с культурой 1 µL стокового раствора, содержащего 40 ng лентивирусного вектора GFP, в свежей культуральной среде, и инкубируйте при 37 °C в течение 48 часов. Для подготовки клеток к иммунофлуоресцентному анализу удалите культуральную среду и зафиксируйте трансдуцированные клетки 4% формальдегидом при комнатной температуре в течение 10 минут.

Затем трижды промойте клетки раствором XPBS по 10 минут за каждую процедуру. Далее погрузите покровные стекла в PBS с добавлением 0,05% Triton X 110% и сыворотки лошади и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. Затем трижды промойте покровные стекла раствором PBS.

Добавьте первичные антитела к GFP в разведении 1:1000 в 100 µL PBS с 4% сыворотки лошади на каждое покровное стекло. Инкубируйте в темном боксе при 4 °C в течение ночи. Затем разведите конъюгированные антитела Alexa Fluor 488 в соотношении 1:200 в PBS с 0,5% tween 20 и инкубируйте клетки с раствором антител при комнатной температуре в течение одного часа, предварительно промыв стекла PBS трижды.

Используйте среду для заключения, чтобы подготовить стекла для флуоресцентной микроскопии. С помощью конфокального микроскопа выберите не менее 10 здоровых нейронов для каждого условия с пирамидальной морфологией и разветвленным дендритным деревом, чтобы количественно оценить от 60 до 100 мкм каждого дендрита. Получите изображения, используя объектив с увеличением 40x, na 1,3 (иммерсионное масло) и лазер с длиной волны 488 нм при типичной пиковой мощности на уровне образца около 20 мкВт; установите размер пикселя около 80 нм для надлежащего сэмплирования дендритных шипиков.

Для сканирования всего объема нейрона выполните сбор Z-стека с шагом по оси Z от 150 до 300 нанометров, чтобы получить от 20 до 30 Z-срезов для проведения 3D-количественного анализа дендритных шипиков. Для предварительной обработки в программном обеспечении для анализа используйте следующие настройки. Примените фильтрацию Гаусса, выбрав в меню обработки изображений сглаживание с помощью фильтра Гаусса.

Установите ширину фильтра равной размеру пикселя в плоскости XY для выполнения полуавтоматического трассирования дендритов с помощью модуля filament tracer. На вкладке slice используйте инструмент distance для оценки диаметра дендрита. Затем на вкладке surpassed нажмите на инструмент filaments и выберите skip automatic creation для повышения надежности на вкладке draw.

Теперь выберите «auto path» в качестве метода, «dendrite» в качестве типа и введите расчетный диаметр дендрита. Используя режим выбора указателя, измените курсор на прямоугольник, зажмите клавишу shift и щелкните правой кнопкой мыши по начальной точке дендрита. Программное обеспечение выполнит предварительные расчеты.

Теперь переместите курсор вдоль дендрита от начальной точки. Желтой линией показан наиболее вероятный путь дендрита. Нажмите shift и клавишу «влево».

Нажмите на конечную точку дендрита в интерфейсе модуля, чтобы выполнить автоматическую сегментацию шипиков. В выпадающем списке «rebuild» выберите вкладку «creation». Выберите «rebuild dendrite diameter» и отметьте флажком поле «keep data».

Затем нажмите rebuild. Установите порог таким образом, чтобы сегментированный объем соответствовал фактическому объему дендрита. В качестве алгоритма выберите shortest distance from distance map.

Затем нажмите кнопку «Next» (Далее) во вкладке «Slice» (Срез), определите минимальный диаметр головки шипика и максимальную длину. Далее во вкладке «Surpass» (Превышение) введите значения параметров: в качестве отправных точек хорошо подходят значения от 200 до 300 nm для минимального диаметра и 4 µm для максимальной длины; не отмечая поле «Allow Spines» (Разрешить шипики), нажмите кнопку «Next» (Далее). Затем отрегулируйте порог начальных точек (seed points threshold) таким образом, чтобы синие точки, представляющие шипики, локализовались непосредственно в головках шипиков.

Затем нажмите «next». Теперь будет выполнен основной расчет, который может занять некоторое время. На вкладке «tools» интерфейса модуля нажмите «classify spine». После подтверждения наличия четырех классов, описанных в текстовом протоколе, интерфейс модуля создаст четыре новых объекта нитей (filament objects) с результатами классификации.

Наконец, экспортируйте статистические данные во вкладке статистики, нажав «export all statistics to file». На данном рисунке представлена культура нейронов человека, меченных антителами к бета-III-тубулину. Здесь также заметна тенденция к кластеризации клеток.

На данном изображении представлен GFP-помеченный параметальный нейрон через 40 дней после дифференцировки из позднего кортикального предшественника. Нейрон расположен в поверхностных слоях коры. На врезке показано изображение с меньшим увеличением, где виден телo клетки.

На этих панелях представлена 3D-реконструкция сегментов дендритных шипиков на разных стадиях созревания. Здесь приведен количественный анализ плотности шипиков и объема их головок. Как и ожидалось, оба этих параметра увеличиваются в течение периода культивирования.

При выполнении процедуры культивирования важно очень осторожно высевать и распределять нейральные стволовые клетки, медленно добавляя их плавными вращательными движениями, чтобы минимизировать слипание клеток. Это необходимо, так как данный метод требует идентификации отдельных нейронов.