Трехмерная Количественное дендритных шипиков пирамидальных нейронов из производных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить изображение дендритных шипиков из перальных нейронов, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, и количественно оценить их в трех измерениях. Это достигается путем предварительной обработки покровных пластинок в шести луночных планшетах полиуретаном и ламинином для культивирования нейральных стволовых клеток. Далее нейральные стволовые клетки разводят в культуре.

Среды покрываются пластинами с помощью мягкого вращающегося движения пипетки и дифференцируются до 70 дней в культуре. При регулярном обновлении среды клетки трансдуцируются лентивирусом GFP, окрашенным антителами против GFP и визуализированными. Наконец, культуры фиксируются, а дендритные шипики визуализируются с помощью конфокальной микроскопии.

В конечном счете, данные изображений дендритных шипиков человека реконструируются в 3D для их классификации и количественной оценки. Этот протокол предусматривает поэтапную процедуру получения глутаматергических нейронов второго – четвертого слоев коры головного мозга человека. Он предполагает использование нейральных стволовых клеток, полученных из индуцированных человеком препотентных стволовых клеток, происходящих из фибробластов человека, на основе ранее опубликованного метода.

Основное преимущество этой методики из существующих нами методик заключается в том, что она позволяет автоматически сегментировать ON right и PY в 3D. Это дает заметную экономию времени по сравнению с существующим программным обеспечением, которое обычно готовится только на основе 2D-анализа. Донр и шпион в классификациях очень удобны и просты в использовании.

Чтобы приготовить нейрональные культуры, поместите стеклянную крышку в шесть луночных чашек для культивирования и добавьте полиорнитин для инкубации в течение ночи под проточным колпаком на следующий день. С помощью DPBS трижды промыть чехол и добавить ламинин для инкубации под проточной крышкой не менее 10 часов. Приготовьте питательную среду, содержащую следующие компоненты.

Затем используйте среду для пластинирования и отправьте нейральные стволовые клетки или NSCS с плотностью 50 000 клеток на квадратный сантиметр пипетирования медленными вращающимися движениями, чтобы уменьшить кластеризацию клеток для трансдукции нейронов, полученных от IPSC человека. На любой стадии созревания добавьте один микролитр исходного раствора, содержащего 40 нанограммов лентивирусного вектора GFP, на культуральную лунку, содержащую свежую питательную среду, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов. Чтобы подготовить клетки к иммунофлюоресценции, удалите питательную среду и с помощью 4%-ного формальдегида закрепите трансдуцированные клетки при комнатной температуре в течение 10 минут.

Затем с помощью одного XPBS промыть клетки три раза по 10 минут каждая. Затем погрузите покровные стекла в PBS с добавлением 0,05% Triton X 110% лошадиной сыворотки и выдерживайте при комнатной температуре в течение одного часа. Затем с помощью PBS трижды промыть чехол

Добавьте одно 1000-е первичное антитело GFP в 100 микролитров 4%-ной лошадиной сыворотки PBS в каждый покровный листок. Инкубировать в темной коробке при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. Теперь разведите конъюгированное антитело Alexa Fluor 4 88 от одного до 200 в PBS 0,5% от 20 и инкубируйте клетки с раствором антитела при комнатной температуре в течение одного часа после использования PBS для трехкратной промывки предметных стекол.

Используйте монтажный носитель для крепления предметных стекол для флуоресцентной микроскопии. Под конфокальным микроскопом выберите не менее 10 здоровых нейронов для каждого состояния с морфологией параметалла и складчатой дендритной арборизацией для количественного определения от 60 до 100 микрометров на дендрит. Получайте изображения с помощью 40 x na, масляного объектива 1,3 и лазера 488 нм с типичной пиковой мощностью на уровне образца около 20 микроватт, установите размер пикселя около 80 нанометров для правильной выборки дендритных шипов.

Чтобы получить выборку всего объема нейрона, получите стек Z с расстоянием Z от 150 до 300 нанометров, что даст от 20 до 30 Z-срезов для проведения 3D-количественного определения дендритных шипов. Используйте следующие настройки для программного обеспечения для анализа для предварительной обработки. Используйте фильтрацию по Гауссу, выбрав фильтр Гаусса для обработки изображений, сглаживание.

Установите ширину фильтра, равную размеру пикселя в плоскости XY, чтобы выполнить полуавтоматическую трассировку дендритов от модуля трассировщика нити накала. На вкладке среза используйте инструмент расстояния для оценки диаметра дендрита. Затем на предыдущей вкладке нажмите на инструмент филаментов и выберите «Пропустить автоматическое создание для лучшей надежности» на вкладке «Рисование».

Теперь представлен выбор автоматического пути в качестве метода, дендрита в качестве типа и ввод предполагаемого диаметра дендрита. Используя режим выбора указателя, превратите курсор в прямоугольник, выберите Shift и щелкните правой кнопкой мыши по начальной точке дендрита. Программное обеспечение выполнит первоначальные расчеты.

Теперь переместите указатель вдоль дендрита от начальной точки. Показана желтая линия, представляющая наиболее вероятный путь дендритов. Нажмите Shift и влево.

Нажмите на конечную точку дендрита, чтобы выполнить автоматическую сегментацию позвоночника в интерфейсе модуля. Нажмите на вкладку создания в выпадающем списке восстановления. Выберите «Восстановить диаметр дендрита» и поставьте галочку в поле «Сохранить данные».

Затем нажмите «Восстановить». Установите порог таким образом, чтобы сегментированный объем соответствовал фактическому объему дендритов. В качестве алгоритма выберите кратчайшее расстояние по карте расстояний.

Затем нажмите кнопку «Далее» под вкладкой «Срез», определите наименьший позвоночник, диаметр головы и максимальную длину. Затем на вкладке «Превзойти» введите значения параметров от 200 до 300 нанометров для минимального диаметра и четыре микрометра для максимальной длины являются хорошими начальными точками, не ставя галочку в поле «разрешить шипы», нажмите кнопку «Далее». Затем отрегулируйте порог начальных точек таким образом, чтобы синие точки, представляющие шипы, были локализованы по отношению к фактическим головкам шипов.

Затем нажмите «Далее». Теперь будет выполнен расчет керна, и может потребоваться время для классификации корешков на вкладке инструментов интерфейса модуля, нажмите на классификацию корешка. После проверки того, что в текстовом протоколе описаны четыре класса, интерфейс модуля сгенерирует четыре новых объекта филамента с результатами классификации.

Наконец, экспортируйте статистические данные на вкладке статистики, нажав на кнопку «Экспортировать всю статистику в файл». На этом рисунке показана культура человеческих нейронов, помеченных антителом против бета-3 тубулина. Здесь также очевидна тенденция к кластеризации клеток.

Здесь показан параметаллический нейрон, меченный GFP, через 40 дней после дифференцировки от позднего предшественника коры головного мозга. Из поверхностных корковых слоев. Врезка показывает меньшее увеличение с видимым телом клетки.

Эти панели представляют собой 3D-реконструкцию сегментов дендритных шипиков на разных стадиях созревания. Здесь представлен количественный анализ плотности позвоночника и объема головки позвоночника. Как и ожидалось, эти два параметра увеличиваются в течение периода культивирования.

Во время процедуры культивирования важно очень осторожно тарифицировать и удалять нейростволовые клетки, медленно добавляя клетки мягкими вращательными движениями, чтобы уменьшить уровень холина в клетках. Действительно, этот метод требует идентификации отдельных нейронов.