Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек

Общая цель данного протокола заключается в создании условий для анализа экспрессии генов с учетом специфики фаз клеточного цикла. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области онкологии, касающиеся зависимых от клеточного цикла транскрипционных событий, которые лежат в основе злокачественной трансформации, а также противоопухолевой терапии. Основным преимуществом данного протокола является возможность точного определения паттернов экспрессии генов, специфичных для фаз клеточного цикла, как в двух контрольных условиях, так и после воздействия химиотерапии.

Для данного эксперимента используются клетки U2OS, которые следует высевать в чашки диаметром 100 мм вечером, около семи часов вечера, чтобы последующие этапы можно было выполнить в рабочее время. Дайте клеткам прикрепиться, инкубируя чашки при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в течение 24 часов.

На следующий день исследуйте клетки, чтобы подтвердить, что они достигли 50% конфлюэнтности. Для тимидиновой блокады добавьте 100 µL свежеприготовленного стокового раствора тимидина с концентрацией 200 mM в каждую культуральную чашку диаметром 100 mm. Инкубируйте клетки с тимидином при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в течение 20 часов.

На следующий день, примерно в 15:00, выведите клетки из тимидинового блока, удалив питательную среду, содержащую тимидин. Дважды промойте клетки предварительно нагретым 1X PBS.

Затем добавьте по 10 milliliters полной среды в каждую чашку диаметром 100 millimeter. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение пяти часов. Для остановки клеток в митозе добавьте нокодазол до конечной концентрации 50 nanograms per milliliter.

Инкубируйте клетки с нокодазолом не более 10–11 часов. На следующее утро, между 6 и 7 часами, проверьте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить их остановку в фазе G2-M, что характеризуется их округлой формой.

Отделите митотические клетки, встряхнув каждую чашку, и осторожно перенесите с помощью пипетки ростовую среду с нокодазолом и отделенными клетками из каждой 100-миллиметровой чашки. Объедините митотические клетки из всех чашек в стерильной пробирке объемом 50 мл. Центрифугируйте при 300 ×g в течение пяти минут при 4 °C.

Промойте клетки дважды, добавив холодный 1X PBS, с последующим центрифугированием. После удаления PBS после второго промывания повторно суспендируйте митотические клетки в полной культуральной среде. Отберите два миллилитра для экстракции РНК и два миллилитра для анализа FACS для временной точки «ноль часов».

Пересейте оставшиеся клетки в фазе митоза в шестилуночные планшеты для последующих временных точек. Для начала этой процедуры высейте по 0,25 × 10⁶ клеток U2OS в каждую лунку шестилуночного планшета. На крышке каждого шестилуночного планшета подпишите экспериментальное условие для каждой лунки.

Например, необработанные клетки или клетки, подвергнутые воздействию препарата в различных концентрациях и в течение разного времени. Позвольте клеткам прикрепиться, инкубируя шестилуночные планшеты в течение ночи. На следующее утро проверьте клетки, чтобы подтвердить, что их конфлюэнтность составляет 50%.

Удалите полную среду из лунок и добавьте по 2 mL предварительно подогретой среды DMEM-Glutamine без FBS в каждую лунку. Инкубируйте клетки еще в течение 24 часов. Для остановки клеточного цикла с помощью гидроксимочевины удалите среду из лунок и замените ее полной средой, содержащей 4 µM свежеприготовленной гидроксимочевины.

Инкубируйте клетки в среде, содержащей гидроксимочевину, в течение 24 часов. Перед выходом клеток из состояния ареста, вызванного гидроксимочевиной, проверьте клетки, чтобы подтвердить факт их остановки в цикле. Удалите среду с гидроксимочевиной из лунок и дважды промойте лунки предварительно нагретым 1X PBS.

После удаления PBS после второй промывки добавьте по два миллилитра полной среды в каждую лунку. Держите планшеты в инкубаторе до момента сбора образцов. Образцы, полученные в результате обоих протоколов синхронизации, собирают одинаковым способом для проведения FACS-анализа и экстракции РНК.

Для анализа методом FACS промойте каждую лунку двумя миллилитрами предварительно нагретого 1X PBS, затем добавьте 0,3 миллилитра предварительно нагретого раствора Trypsin-EDTA для отсоединения клеток. Через пять минут инактивируйте Trypsin-EDTA, добавив один миллилитр полной среды. Соберите каждый образец в отдельную пробирку объемом 15 миллилитров.

Центрифугируйте клетки при 300 ×g при комнатной температуре в течение пяти минут. Удалите супернатант, промойте клетки 1X PBS и снова центрифугируйте. Удалите PBS и сохраните клеточный осадок.

Для фиксации клеток каждую клеточную пеллету ресуспендируют в 1 мл охлажденного 70% этанола путем осторожного перемешивания на вортексе. Перед окрашиванием пропидиумидом и проведением FACS-анализа клетки выдерживают на льду примерно 15 минут. Для экстракции РНК удаляют среду и промывают каждую лунку 2 мл предварительно подогретого 1X PBS.

Перенесите планшет в шкаф биологической безопасности и добавьте в каждую лунку по 1 мл подходящего реагента для выделения РНК. Несколько раз пропипетируйте содержимое для перемешивания и лизиса клеток, затем перенесите каждый клеточный лизат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут.

Начните процедуру экстракции РНК, достав из морозильной камеры микроцентрифужные пробирки с образцами в реагенте для изоляции РНК и разморозив их при комнатной температуре внутри шкафа для работы с химическими веществами. Добавьте 400 microliters хлороформа в каждый образец и интенсивно встряхните без использования вортекса до полного перемешивания. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение пяти минут.

Центрифугируйте пробирки в течение 15 минут в настольной микроцентрифуге. Перенесите водную фазу каждого образца в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 milliter. Медленно, по каплям, добавьте один объем 100%ethanol к водной фазе при перемешивании.

Не центрифугируйте. Перенесите до 700 µL каждого образца, включая любой образовавшийся осадок, в спин-колонку в коллекционном пробирке объемом 2 mL из коммерческого набора для мини-препарации РНК и закройте крышку. Центрифугируйте в течение 15 секунд.

Удалите фильтрат. Если исходный объем образца превышал 700 µL, перенесите оставшуюся часть образца в спин-колонку и повторно центрифугируйте. После промывки РНК в соответствии с инструкциями производителя элюируйте каждый образец, внеся пипеткой от 30 до 40 µL воды, свободной от нуклеаз, в спин-колонку, и центрифугируя при комнатной температуре в течение одной минуты.

Определите концентрацию и чистоту РНК в образцах с помощью измерений абсорбции. Храните образцы РНК при температуре минус 80 °C до использования для анализа экспрессии генов. Обработка по протоколу с тимидином и нокодазолом вызывает остановку клеток U2OS на этапе входа в M-фазу, что позволяет получить популяцию клеток, синхронно переходящих в G1-фазу и затем в S-фазу, что подтверждается анализом методом проточной цитометрии.

Обработка по протоколу с использованием гидроксимочевины приводит к остановке клеток на границе фаз G1/S. После снятия блокада cells синхронно переходят через S- и G2-фазы. Протокол с использованием тимидина и нокодазола наиболее подходит для анализа профилей мРНК генов с пиком экспрессии в G1-фазе.

Как показано для экспрессии E2F1. Напротив, протокол с гидроксимочевиной лучше подходит для анализа генов с преимущественной экспрессией в фазах S или G2, что проиллюстрировано для экспрессии E2F7. Клеточный цикл обычно нарушается под воздействием противоопухолевых препаратов; на рисунке показано, что митомицин C вызывает стойкую остановку в фазе G2 в клетках, синхронизированных с помощью гидроксимочевины.

Синхронизация клеток помогает отличить гены, реагирующие на противоопухолевый агент, от тех, на которые влияют исключительно нарушения клеточного цикла, вызванные этим агентом; например, снижение уровней мРНК E2F1 после обработки митомаицином C, вероятно, является косвенным эффектом действия препарата на динамику клеточного цикла. Напротив, пик экспрессии мРНК p21-Cip1 после обработки митомаицином C является прямым результатом транскрипционной программы, запущенной этим препаратом. После выполнения данной процедуры можно провести полногеномный транскриптомный и протеомный анализы, чтобы выявить глобальные изменения экспрессии генов, затрагивающие определенные фазы клеточного цикла.

Либо в двух различных условиях, либо при проведении противоопухолевой терапии. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о процедурах, необходимых для проведения анализа экспрессии генов в синхронизированных клеточных культурах. Не забывайте, что работа с пропидиййодидом или реагентами для выделения РНК может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и работа в вытяжном шкафу для химических веществ.