Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек

Общая цель данного протокола состоит в том, чтобы обеспечить контекст для анализа экспрессии генов специфичным для клеточного цикла образом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака, связанные с зависимыми от клеточного цикла транскрипционными событиями, лежащими в основе злокачественной трансформации, а также с противораковым лечением. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он с точностью устанавливает специфичные для фаз клеточного цикла паттерны экспрессии генов как в условиях номер два, так и после воздействия химиотерапии.

Для этого эксперимента используются клетки U2OS, которые должны быть посажены в 100-миллиметровые чашки вечером около семи часов вечера, чтобы последующие шаги можно было провести в рабочее время. Позвольте клеткам прикрепиться, инкубируя чашки при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 5% CO2 в течение 24 часов.

На следующий день исследуйте клетки, чтобы подтвердить, что их конфлюенция составляет 50%. Для тимидинового блока добавьте 100 микролитров свежеприготовленного 200-миллиметрового бульона тимидина в каждую 100-миллиметровую чашку для культивирования. Инкубируйте клетки с тимидином при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 5% CO2 в течение 20 часов.

На следующий день, примерно в три часа дня, освободите клетки из тимидинового блока, удалив питательную среду, содержащую тимидин. Промойте ячейки дважды с предварительно подогретым 1X PBS.

А затем в каждую 10 миллиметровую посуду добавляем по 10 миллилитров полной среды. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти часов. Для остановки митотических клеток добавляют нокодазол до конечной концентрации 50 нанограмм на миллилитр.

Инкубируйте клетки с нокодазолом не дольше 10 – 11 часов. На следующее утро, между шестью и семью часами утра, проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они действительно заблокированы в G2-M, о чем свидетельствует их округлый вид.

Отделите митотические клетки, встряхивая каждую пластину, и осторожно пипетируйте нокодазол, содержащий питательную среду, с отделенными клетками с каждой 100-миллиметровой пластины. Соедините митотические клетки из всех посуд в стерильную пробирку на 50 миллилитров. Центрифугируйте 300 раз g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Промойте ячейки дважды, добавив холодный 1X PBS, с последующим центрифугированием. После удаления PBS со второй промывки повторно суспендировать митотические клетки в полной питательной среде. Оставьте два миллилитра для экстракции РНК и два миллилитра для анализа FACS для нулевого часового времени.

Перетаривайте оставшиеся митотические клетки для последующих временных точек в шести луночных планшетах. Чтобы начать эту процедуру, затравите от 0,25 до 10 до шестой U2OS клеток на лунку в шести луночных планшетах. На крышке каждой пластины с шестью лунками напишите экспериментальное состояние для каждой лунки.

Например, необработанные или обработанные с разной концентрацией препарата и временными точками. Позвольте клеткам прикрепиться, инкубируя шесть луночных планшетов в течение ночи. На следующее утро исследуйте клетки, чтобы подтвердить, что они находятся на 50% конфлюенции.

Удалите всю среду из лунок и добавьте два миллилитра предварительно подогретой среды DMEM-Glutamine без FBS на лунку. Инкубируйте клетки еще 24 часа. Для задержания клеток гидроксимочевиной удалите среду из лунок и замените ее свежеприготовленной четырехмикромолярной гидроксимочевиной, содержащей полноценную среду.

Инкубировать клетки в среде, содержащей гидроксимочевину, в течение 24 часов. Прежде чем высвобождать клетки из опосредованного гидроксимочевиной ареста, проверьте клетки, чтобы убедиться, что они арестованы. Удалите из лунок среду, содержащую гидроксимочевину, и дважды промойте лунки предварительно подогретым 1X PBS.

После удаления PBS со второй промывки добавьте два миллилитра полной среды на лунку. Держите тарелки в инкубаторе до сбора пробы. Образцы из обоих протоколов синхронизации собираются одинаково для анализа FACS и для экстракции РНК.

Для анализа FACS промойте каждую лунку двумя миллилитрами предварительно подогретого 1X PBS, а затем добавьте 0,3 миллилитра предварительно подогретого раствора Trypsin-EDTA, чтобы отделить клетки. Через пять минут инактивируйте Трипсин-ЭДТА, добавив один миллилитр полной среды. Соберите каждый образец в отдельную пробирку объемом 15 миллилитров.

Центрифугируйте ячейки при 300-кратном перегрузке при комнатной температуре в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость, постирайте с 1X PBS и снова отжмите. Удалите PBS и сохраните клеточную гранулу.

Чтобы зафиксировать клетки, повторно суспендируйте каждую клеточную гранулу в одном миллилитре охлажденного 70% этанола путем осторожного вортекса. Поместите клетки на лед примерно на 15 минут перед окрашиванием йодидом пропидида и анализом FACS. Для извлечения РНК удалите среду и промойте каждую лунку двумя миллилитрами предварительно подогретого 1X PBS.

Отнесите планшет в защитный шкаф и добавьте один миллилитр подходящего реагента для выделения РНК в каждую лунку. Пипетируйте вверх и вниз, чтобы пипетировать и лизировать клетки, а затем переносите лизат каждой клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Выдерживать при комнатной температуре в течение пяти минут.

Начните процедуру экстракции РНК с извлечения из морозильной камеры микроцентрифужных пробирок с образцами в реагенте для выделения РНК и размораживания их при комнатной температуре в безопасном шкафу для химических веществ. Добавьте 400 микролитров хлороформа в каждый образец и энергично встряхните, не завихривая, до полного перемешивания. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение пяти минут.

Центрифугируйте пробирки в течение 15 минут в настольной микроцентрифуге. Перенесите водную фазу каждого образца в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллитера. Добавляйте один объем 100% этанола медленно, капля за каплей, в водную фазу во время перемешивания.

Не центрифугировать. Перенесите до 700 микролитров каждого образца, включая осадок, который мог образоваться в спин-колонку, в двухмиллилитровую пробирку для сбора, предоставленную коммерческим мини-набором для подготовки РНК, и закройте крышку. Центрифугируйте в течение 15 секунд.

Откажитесь от проточного потока. Если вы начинаете с более чем 700 микролитров на образец, переведите оставшийся образец в спин-колонку, и снова центрифугируйте. После промывки РНК в соответствии с инструкциями производителя элюируйте каждый образец, пипетируя от 30 до 40 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, в спиновую колонку и центрифугируя при комнатной температуре в течение одной минуты.

Определение концентрации РНК и чистоты образцов с помощью измерений абсорбции. Храните образцы РНК при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования для анализа экспрессии генов. Лечение по протоколу Тимидин-Нокодазол останавливает U2OS-клетки при входе в m-фазу и обеспечивает популяцию клеток, которая синхронно прогрессирует через G1 и в S-фазу, как показано при анализе проточной цитометрии.

Лечение по протоколу гидроксимочевины останавливает клетки на границе G1/S. После высвобождения клетки синхронно переходят через фазы S и G2. Протокол тимидин-нокодазол наиболее подходит для анализа профилей мРНК генов с пиковой экспрессией во время фазы G1.

Как показано для выражения E2F1. В отличие от этого, протокол гидроксимочевины лучше подходит для анализа генов с преимущественной экспрессией в S или G2, как показано для экспрессии E2F7. Клеточный цикл обычно нарушается противоопухолевыми препаратами, показано, что митомицин С вызывает постоянный остановку фазы G2 в клетках, синхронизированных с гидроксимочевиной.

Синхронизация клеток помогает отличить гены, реагирующие на противоопухолевый агент, от генов, на которые влияют исключительно нарушения клеточного цикла, вызванные агентом, например, снижение уровня мРНК E2F1 после лечения митомицином С, вероятно, является косвенным влиянием препарата на динамику клеточного цикла. Напротив, пик экспрессии мРНК p21-Cip1 после лечения митомицином С является прямым результатом транскрипционной программы, запускаемой этим препаратом. После этой процедуры может быть проведен полногеномный транскриптомный, а также протеомный анализ, чтобы выявить глобальные изменения экспрессии генов, влияющие на конкретные фазы клеточного цикла.

Либо при двух состояниях, либо при противоопухолевом лечении. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать процедуры, которые требуются для выполнения анализа экспрессии генов в синхронизированных клеточных культурах. Не забывайте, что работа с йодидом пропидия или реагентами для выделения РНК может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как перчатки и защитный шкаф для химических веществ.