Манипуляции и анализ процессов, зависящих от клеточного цикла, у почковающихся дрожжей

Мы изучаем, как делящиеся клетки верно передают свои хромосомы во время митоза, сосредотачиваясь на молекулярных машинах и механизмах, обеспечивающих точную сегрегацию хромосом. Мы синхронизируем клетки, чтобы изучать молекулярные процессы, которые меняются вместе с клеточным циклом. Без этих методов ключевые изменения были бы скрыты в несинхронизированной популяции клеток.

По сравнению с другими методами синхронизации, остановка альфа-фактора у мутантов BAR1 обеспечивает более чистую, обратимую G1-остановку, позволяя отслеживать целую культуру дрожжей, развивающуюся синхронно по циклу. Наша работа выявляет динамическую локализацию белков и изменения активности на протяжении всего клеточного цикла, проливая свет на ключевые митотические процессы, такие как сегрегация хромосом и поддержание веретена. Для начала инокулятируйте дрожжи в 25 миллилитров среды YPAD и инкубируем за ночь, чтобы достичь оптической плотности 600 нанометров от 0,5 до 2,0.

Разбавить клетки дрожжей до оптической плотности 600 нанометров — 0,5. Добавьте альфа-фактор в культуру, чтобы достичь конечной концентрации один микрограмм на миллилитр. Через 2,5–3,5 часа после добавления альфа-фактора подсчитайте под микроскопом процент клеток, не запущенных шму, чтобы оценить остановку клеток.

Затем прокрутите культуру в центрифуге при 3 000 г в течение трёх-пяти минут при 23 градусах Цельсия. Аккуратно вылейте супернатант, чтобы удалить альфа-фактор. Суспензировать клеточную гранулу в 25 миллилитрах YPAD с 1% диметилсульфоксидом для промывки клеток.

Перенесите клеточную гранулу в новую трубку и повторите промывки ещё дважды, всего три промывания, чтобы удалить остатки альфа-фактора. Далее добавьте YPAD к промытым ячейкам, чтобы увеличить итоговый объём до 25 миллилитров, и перенесите подвеску в новую колбу для дальнейшей инкубации или использования. Соберите образец с нулевым временем сразу после выпуска и исправьте образец.

Через 60 минут после выпуска оценивайте синхронность популяции клеток под световым микроскопом. При желании добавьте альфа-фактор снова через 60 минут после выпуска до конечной концентрации один микрограмм на миллилитр, чтобы заблокировать переход в следующий клеточный цикл. Продолжайте собирать образцы с временными точками каждые 15 минут до 180 минут или в течение необходимого времени.

Чтобы закрепить клетки дрожжей, центрифугуйте один миллилитр культуры на одну минуту на максимальной скорости. Полностью аспирируйте супернатант. Затем суспендировать гранулу в 500 микролитрах фиксирующего раствора и инкубировать при 23 градусах Цельсия в течение двух до пятнадцати минут.

После центрифугирования фиксированных клеток аспирируете супернатант и ресуспензируйте гранулу в 500 микролитрах буфера с фосфатом калия с размером 0,1 моля при pH 6,4. Перед визуализацией центрифугайте фиксированные клетки при 23 градусах Цельсия в течение одной минуты на максимальной скорости. После аспирации гранулы снова суспензируют в растворе тритона, DAPI и сорбитола.

Пипетта примерно 0,8 микролитра окрашенной клеточной суспензии прямо в центр чистого покрытия. Используйте наконечник пипетки, чтобы аккуратно распределить каплю по кругу примерно один квадратный сантиметр. Поместите накладку на микроскопический слайд.

С помощью Kimwipe аккуратно нажмите по краям коверслипа, чтобы равномерно распределить образец. Затем запечатайте края покрытия лаком для ногтей, чтобы закрепить образец. Отнесите подготовленный слайд к микроскопу, оснащённому масляным погружным объективом с 60-кратным увеличением и числовой апертурой 1,42, а также красным, зелёным, синим и дальним красным лазером и фильтром.

Сфокусируйте микроскоп на дрожжевых клетках, приклеенных к укрытию. После фокусировки настройте настройки экспозиции для каждого флуоресцентного канала, чтобы получить соотношение сигнал/шум не менее трёх к одному. Настройте настройки сбора так, чтобы собрать от 14 до 20 z-стековых изображений с каждым срезом на расстоянии 0,2 микрометра друг от друга, охватывая общую глубину z от двух до четырёх микрометров.

На микроскопах с модулями постобработки выбирайте опции Deconvolution и Quick Projection для каждого изображения в z-стеке. Собрать z-стеки образца, зафиксировав достаточно изображений для записи примерно 100–200 клеток дрожжей для каждого экспериментального состояния или временной точки. Для анализа откройте проецируемые изображения в программном обеспечении ImageJ.

Регулируйте яркость и контраст каждого люминесцентного канала для улучшения видимости. Для анализа прогрессирования клеточных циклов посчитайте по 100 клеток на каждую временную точку и классифицируйте их как содержащие одно или два ядра. Чтобы рассчитать процент ячеек, показывающих пункт Stu2-GFP, стандартизируйте настройки яркости зелёного канала для всех изображений.

Ячейки, показывающие пункт Stu2-GFP, которые солокализуются со Spc110-mCherry puncta положительно на локализацию кинетохора. Далее, чтобы количественно определить интенсивность белка пункта, используйте инструмент свободного выбора, чтобы обозначить интересующую область вокруг сигнала. Добавьте выбор в Менеджер региона интереса, нажав T или выбрав эту опцию в меню ROI Manager.

В ROI Manager нажмите Измерить, чтобы рассчитать интенсивность пункта. Чтобы визуализировать изменения со временем, постройте среднюю интенсивность с интервалами 95% доверия для каждой точки. Посчитайте примерно 100 клеток на каждое состояние.

В клетках, арестованных G1, Stu2-GFP локализовался в одношпиндельном полюсном проксимальном пунктуме с дополнительным дисперсным сигналом вдоль цитоплазматических микротрубочков. Через 60 минут после выпуска Stu2-GFP локализировался как два пункта рядом с дублированными полюсами шпинделя, отмеченными Spc110-mCherry. К 90 минутам, во время анафазы, Stu2-GFP появился как возле полюсов веретена, так и вдоль микротрубочок вдоль одной оси.

После митотического выхода, на 120-й минуте, Stu2-GFP вновь появился на астральных микротрубочках цитоплазмы. Количественная оценка показала, что интенсивность Stu2-GFP возле полюсов веретена увеличивалась в раннем митозе, достигая пика до анафазы и снижаясь после этого. Процент бинуклеатных клеток достиг пика примерно на 90 минутах, что указывает на синхронный вход в анафазу.