Сочетание митотическая клеток синхронизации и конфокальная микроскопия высокого разрешения для изучения роли многофункциональный клеточного цикла белков во время митоза

Общая цель этой процедуры заключается в использовании двойной синхронизации тимидина и конфокальной микроскопии высокого разрешения для изучения митотической роли многофункциональных белков, которые могут обладать критическими интерфазными функциями. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии о том, как очертить нормальные функции белков, участвующих в клеточном цикле и митозе. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что клетки могут поддерживать свое нормальное физиологическое поведение, а также в том, что этот метод очень прост в применении.

Демонстрировать эту процедуру будет доктор Мохаммед Амин, постдок из моей лаборатории, который является экспертом по использованию этого метода. Для визуализации митотической клеточной прогрессии с фиксированными клетками начните с посева примерно в два раза от 10 до пятой части клеток HeLa в каждую лунку шестилуночного планшета, содержащего 70% этанол и стерилизованный УФ-покрытием покровный лист и два миллилитра среды DMEM. После 24 часов в инкубаторе для клеточных культур заблокируйте клетки двумя миллилитрами свежеразведенного тимидина и свежей среды на лунку, и верните планшет в инкубатор еще на 18 часов.

На следующий день промойте клетки два раза двумя миллилитрами PBS, и один раз свежей средой 37 градусов Цельсия. Верните клетки в инкубатор на девять часов, чтобы освободить клетки из блока, с последующим добавлением еще двух миллилитров среды, дополненной тимидином, на лунку. После второй блокирующей инкубации промойте клетки два раза двумя миллилитрами PBS, и один раз двумя миллилитрами свежей среды 37 градусов Цельсия, и добавьте в соответствующие лунки 100 наномоляров свежеприготовленной миРНК.

Через 9-10 часов аспирируйте надосадочную жидкость и зафиксируйте клетки на покровной стеколе четырехпроцентным содержанием параформальдегида в течение 20 минут при комнатной температуре. После промывки PBS неподвижные ячейки пропитать 0,5% моющим средством в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего следует две пятиминутные промывки в PBS. Заблокируйте клетки одним процентом БСА в PBS на один час при комнатной температуре.

Затем пометьте клетки 50 микролитрами первичных антител, представляющих интерес, в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубации трижды промойте клетки в PBS и пометьте их 50 микролитрами соответствующих вторичных антител, представляющих интерес. Через час при комнатной температуре промойте клетки два раза в PBS по пять минут при каждой промывке и пометьте клетки DAPI в течение пяти минут при комнатной температуре.

После окрашивания DAPI нанесите два пятиминутных промывки в PBS и используйте соответствующую монтажную среду для крепления защитных стекол на отдельных прозрачных предметных стеклах микроскопа. Затем, используя план апохроматических масляных иммерсионных объективов DIC с числовой апертурой 60 или 100 X 1,4, установленных на инвертированном конфокальном микроскопе высокого разрешения, оснащенном соответствующей камерой, получить изображения иммуноокрашенных белков в стеках Z толщиной 0,2 микрометра. Для визуализации митотической клеточной прогрессии в живых клетках засейте примерно от 0,5 до 10 до пятой части клеток HeLa, стабильно экспрессирующих mCherry H2B и альфа-тубулин GFP, в 35-миллилитровые чашки со стеклянным дном, содержащие 1,5 миллилитров среды DMEM.

Выращивайте клетки в инкубаторе для клеточных культур в течение 24 часов. Затем тимидин блокирует клетки два раза, как только что было продемонстрировано, на этот раз промывая клетки два раза двумя миллилитрами PBS и один раз одним миллилитром предварительно подогретой среды DMEM в конце каждого тимидинового блока, а также обрабатывая клетки миРНК после первого блока во время первого вымывания тимидина. Выращивайте клетки в свежей предварительно подогретой среде Лейбовица с добавлением 10% FBS и 20 миллимолярных HEPES в течение восьми часов, чтобы освободить клетки из второго блока.

Затем поместите первую пластину в камеру конфокального микроскопа с высоким разрешением с регулируемой температурой и используйте 60-кратный объектив и визуализацию в ярком поле, чтобы сфокусировать клетки. Когда ячейки видны, вручную отрегулируйте положение пластины в соответствии с выбранной областью и используйте программное обеспечение для получения изображений, чтобы установить мощность лазера и экспозицию, параметры получения изображений и период продолжительности эксперимента. Выберите подходящие фильтры GFP и mCherry и получайте импульсные изображения проходящего света и флуоресценции каждые 10 минут в течение 16 часов, чтобы получить покадровые изображения процесса митоза.

Через девять часов после высвобождения из двойного тимидинового блока получите изображения в 12 z-плоскостях с интервалом в один микрометр. Затем проанализируйте изображения, отслеживая отдельные митотические клетки, и используйте соответствующее исходное программное обеспечение для сборки соответствующего фильма. Несмотря на то, что большинство контрольных клеток и клеток миРНК Cdt1 находятся на стадии метафазы через девять часов после высвобождения из двойного тимидинового блока, фиксация через 10 часов показывает, что большинство клеток, обработанных миРНК Cdt1, все еще задерживаются в поздней прометафазе, в то время как контрольные клетки входят в анафазу и разделяют свои хромосомы, как и ожидалось.

Лечение холодом через девять часов после высвобождения из двойного тимидинового блока способствует сохранению стабильных микротрубочек кинетохора, которые относительно менее устойчивы в клетках с истощением Cdt1 по сравнению с клетками в контрольной группе. Лицензирование источника репликации ДНК не нарушается в клетках с истощением Cdt1 или контролем во время фазы G2-M, поскольку не было обнаружено, что эти клетки индуцируют накопление фосфоралированного гамма H2AX, маркера повреждения ДНК, во время последующей фазы G2. Трансфекция миРНК Cdt1 асинхронных культур, однако, индуцирует накопление фосфогамма-положительных фокусов H2AX, возможно, из-за повреждения ДНК, вызванного неправильным лицензированием репликации ДНК.

После распада ядерной оболочки нормальные клетки вступают в митоз и подвергаются анафазному началу, чтобы выйти из митоза в течение примерно 30-60 минут. РНК-опосредованный нокдаун Hec1, ключевого кинетохорного белка, необходимого для формирования крепкого прикрепления микротрубочек кинетохора, тем не менее, задерживает нормальное митотическое прогрессирование до начала анафазы или выхода из митоза даже после нескольких часов задержки митоза. После освоения этой техники ее можно завершить за три-четыре дня, если она выполнена правильно.

Пытаясь провести процедуру, важно помнить о полном растворении тимидина после того, как вы разморозите его из морозильной камеры. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как вестерн-блоттинг, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, каковы паттерны экспрессии белков, представляющих интерес во время митоза, по сравнению с интерфазой? После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии к изучению биогенеза рака в моделях клеточных культур человека, а также к использованию конфокальной микроскопии высокого разрешения для идентификации функций, связанных с клеточным циклом белков, представляющих интерес.

Не забывайте, что работа с такими реагентами, как параформальдегид и DAPI, может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лабораторного халата.