Генерация генетически модифицированных мышей посредством микроинъекции ооцитов

Общая цель данного протокола — описать процедуры, необходимые для успешного создания генетически модифицированных мышей путем микроинъекций в ооциты. Этот протокол может быть полезен исследователям и техническому персоналу, работающим как в области генезиса мышей, так и в области таргетного генного модифицирования. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он основан на прямой инъекции в ооциты мыши, как для случайной интеграции, так и для таргетного генного модифицирования, что позволяет получить генетически модифицированных мышей всего за шесть недель.

Для подготовки одной гидовой РНК, после выбора двух подходящих целевых последовательностей и изготовления праймеров согласно текстовому протоколу, синтезируйте линейный матричный ДНК, разбавив плазмиду PX330 в воде, свободной от нуклеаз, до концентрации 10 nanograms per microliter. Приготовьте мастер-микс, добавив полимеразу в самом конце, и храните его на льду. Затем перемешайте раствор и разлейте его по восьми ПЦР-пробиркам.

Добавьте по 1 µL PXR330 в каждую пробирку и запустите следующую программу. Затем, используя набор для очистки ПЦР-продуктов, манифольд и источник вакуума, очистите ПЦР-продукт. Добавьте пять объемов буфера для связывания к одному объему ПЦР-образца и перемешайте.

Установите спин-колонку с кремниевой мембраной на манифольд. Для связывания ДНК нанесите все восемь образцов в колонку при вакууме. Для промывки образца добавьте в колонку 0.75 milliliters промывочного буфера и примените вакуум.

Затем центрифугируйте колонку при 12 000 ×g в течение 60 секунд, чтобы удалить остатки этанола. Поместите колонку в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, затем, для элюции ДНК, добавьте 30 µL воды, свободной от нуклеаз, в центр мембраны. Оставьте колонку на одну минуту, после чего центрифугируйте ее при 12 000 ×g в течение 60 секунд.

Затем с помощью спектрофотометра измерьте концентрацию ДНК. Для проведения транскрипции in vitro с использованием набора для синтеза РНК T7 подготовьте мастер-микс и инкубируйте реакционную смесь в термоциклере при 37 °C в течение трех часов. Добавьте 28 µL воды, свободной от нуклеаз, и 2 µL DNase I, после чего инкубируйте реакцию еще 15 минут.

Для очистки РНК растворите порошок, содержащийся в прилагаемой спиновой колонке, в 650 µL микроинъекционного буфера, свободного от нуклеаз. Осторожно удалите все пузырьки воздуха, закройте пробирку крышкой и выдержите раствор при комнатной температуре от 5 до 15 минут для гидратации. Снимите синий колпачок снизу и поместите колонку в пробирку объемом 2 мл.

Затем центрифугируйте пробирку при 750 ×g при комнатной температуре в течение двух минут. После этого поместите колонку в новую пробирку объемом 1.5 мл и по каплям нанесите 50 µL раствора РНК в центр, не касаясь стенок колонки. Затем центрифугируйте колонку при 750 ×g в течение двух минут.

Измерьте концентрацию РНК и оцените ее качество в соответствии с текстовым протоколом. Используя безнуклеазный буфер для микроинъекций, разведите мРНК Cas9 до концентрации 50 ng/µL, а sgRNA — до 12,5 ng/µL для экспериментов по нокауту генов. Добавьте донорский шаблон в концентрации 200 ng/µL для редактирования генома на основе гомологичной рекомбинации и храните смесь на льду.

Используйте наконечник аспиратора, чтобы промыть ооциты четырьмя свежими каплями казеиновых аминокислот. Затем перенесите их в финальную каплю среды Casome 8, покрытую минеральным маслом. Чтобы провести инъекцию в пронуклеус для рандомной интеграции, под стереомикроскопом с помощью наконечника аспиратора перенесите примерно 50 яиц в каплю среды M2, покрытую минеральным маслом, которая будет служить камерой для инъекций.

Перенесите инъекционную камеру на перевернутый микроскоп и введите в оплодотворенные ооциты несколько пиколитров инъекционной смеси. Если инъекция прошла успешно, пронуклеус увеличится в объеме. Для таргетного мутагенеза выполните цитоплазматическую инъекцию; с помощью дозатора перенесите примерно 50 яиц в каплю casome A, содержащую 5 µg/mL цитохалазина B, и инкубируйте их при 37 °C и 5% CO2 в течение пяти минут.

Перенесите яйцеклетки в инъекционную камеру, затем при очень низком давлении введите несколько пиколитров инъекционной смеси в цитоплазму. По возможности используйте компенсирующее давление автоматического микроинъектора. После инъекции с помощью пипетки перенесите ооциты обратно в каплю казоаминокислот.

Поддерживайте их при температуре 37 °C и 5% carbon dioxide до момента их переноса для реимплантации в яйцевод ложнобеременных самок. После проведения анестезии самки мыши с наличия вагинальной пробкой в соответствии с текстовым протоколом, для выполнения реимплантации в стерильных условиях обнажите репродуктивный тракт, сделав скальпелем разрез длиной 1 см параллельно срединной линии спины. Затем с помощью ножниц рассеките мышцы и с помощью пинцета захватите жировую прослойку.

Осторожно извлеките яичник так, чтобы прикрепленные к нему яйцевод и матка стали четко видны. Затем с помощью сосудистого зажима зафиксируйте жировую подушку. Под стереомикроскопом с помощью микроножниц сделайте надрез в стенке яйцевода в нескольких миллиметрах выше ампулы.

Кроме того, под стереомикроскопом загрузите 25 микроинъецированных яиц в стеклянный капилляр, соединенный с мундштуком. Затем введите стеклянный капилляр в яйцевод и вытолкните яйца до появления пузырька воздуха внутри ампулы. Чтобы убедиться в успешности реимплантации, необходимо проверить наличие пузырька воздуха в ампуле, что гарантирует выталкивание всех яиц в нужное место и отсутствие остатков яиц в стеклянном капилляре.

Осторожно извлеките стеклянный капилляр и верните репродуктивный тракт в брюшную полость. Затем с помощью нерассасывающихся хирургических нитей размера 000 наложите швы на разрез, после чего закройте кожу с помощью раневых скоб. Поместите мышь на грелку для предотвращения гипотермии и подкожно введите анальгетик.

Наблюдайте за мышью до полного выздоровления. В завершение проведите генотипирование и секвенирование согласно текстовому протоколу. На данном рисунке представлены аналитические гели, демонстрирующие качество очистки трансгена и синтеза sgRNA, что является критически важным для успешного создания генетически модифицированных мышей.

Здесь представлен типичный результат сессии микроинъекций для случайной интеграции. Праймер для генотипирования должен располагаться на трансгене и быть разработан таким образом, чтобы генерировать фрагмент размером от 200 до 800 пар оснований. В данном анализе генного таргетинга праймеры подобраны так, чтобы гибридизироваться с геномной ДНК за пределами области, которая в конечном итоге вырезается двумя сайтами.

Данная стратегия позволяет напрямую идентифицировать гетерозиготных и гомозиготных основателей с нокаутом. Как показано здесь, при оптимизации каждого этапа протокола процент трансгенных детенышей должен составлять от 10% до 25% при случайной интеграции, что несколько низко по сравнению со способностью компонентов CRISPR редактировать геном мыши. При использовании CRISPR для таргетного редактирования генов число основателей обычно выше и составляет от 25% до 100%; при редактировании с помощью CRISPR нередко случается, что все потомство оказывается успешно гомозиготным.

После разработки эта методика позволит исследователям в таких областях, как, например, нейробиология или онкология, использовать новые модели масок для выявления патологических механизмов и, в конечном итоге, внедрения этих знаний в терапевтические стратегии.