Генерация генетически модифицированных мышей посредством микроинъекции ооцитов

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы описать процедуры, необходимые для успешного создания генетически модифицированных мышей путем микроинъекции ооцитов. Этот протокол может помочь исследователям и техническому персоналу, занимающимся как генезисом мышей, так и нацеливанием на гены. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он основан на прямом введении мышиных ооцитов, как для случайной интеграции, так и для нацеливания на гены, что позволяет создавать генетически модифицированных мышей всего за шесть недель.

Чтобы получить одну направляющую РНК, после выбора желаемых двух последовательностей-мишеней и изготовления праймеров по текстовому протоколу, синтезировать линейную матрицу ДНК путем разбавления плазмиды PX330 до 10 нанограммов на микролитр в воде, свободной от нуклеазы. Приготовьте мастер-смесь, добавив полимеразу в конце, и держите на льду. Затем смешайте и разделите раствор на восемь ПЦР-пробирок.

Добавьте один микролитр PXR330 на пробирку и запустите следующую программу. Далее используйте набор для очистки ПЦР, коллектор и источник вакуума для очистки продукта ПЦР. Добавьте пять объемов связывающего буфера к одному объему образца ПЦР и перемешайте.

Поместите спиновую колонну с силиконовой мембраной на коллектор. Чтобы связать ДНК, нанесите все восемь образцов на колонку в вакууме. Чтобы промыть образец, добавьте в колонку 0,75 миллилитра буфера для промывки и пропылесосьте.

Затем центрифугируйте колонку при 12 000 умноженных на G в течение 60 секунд, чтобы удалить остаточный этанол. Поместите колонку в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, затем, чтобы элюировать ДНК, добавьте 30 микролитров воды, свободной от нуклеазы, в центр мембраны. Дайте колонне постоять одну минуту и центрифугируйте ее в 12 000 раз G в течение 60 секунд.

Затем с помощью спектрофотометра измерьте концентрацию ДНК. Чтобы провести транскрипцию in vitro с помощью набора для синтеза РНК t7, приготовьте мастер-смесь и инкубируйте реакцию в термоамплитере при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Добавьте 28 микролитров воды, свободной от нуклеазы, и два микролитра ДНКазы и инкубируйте реакцию еще 15 минут.

Для очистки РНК растворите порошок, содержащийся в прилагаемой спиновой колонке, и 650 микролитров микробуфера для микроинъекций без нуклеазы. Тщательно удалив все пузырьки воздуха, закупорьте пробирку крышкой и увлажните раствор при комнатной температуре в течение пяти-15 минут. Снимите синий колпачок внизу и поместите колонку в двухмиллилитровую трубку.

Затем центрифугируйте пробирку при 750 умноженных на G при комнатной температуре в течение двух минут. Затем поместите колонку в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра и нанесите 50 микролитров раствора РНК по каплям в центр, не касаясь стенки колонки. Затем вращайте колонну со скоростью 750 G в течение двух минут.

Измерьте концентрацию РНК и оцените качество РНК в соответствии с текстовым протоколом. Используя микроинъекционный буфер без нуклеазы, разбавьте корпус девятью мРНК до 50 нанограмм на микролитр и sgРНК до 12,5 нанограммов на микролитр для экспериментов по нокауту генов. Добавьте донорский шаблон в концентрации 200 нанограмм на микролитр, для редактирования генома на основе прямой репарации гомологии и держите его на льду.

Используйте мундштук с аспиратором, чтобы промыть ооциты четырьмя свежими каплями аминокислот казеина. И переложите их в финальную каплю касомы восьмой среды, покрытую минеральным маслом. Чтобы осуществить про ядерный впрыск для случайной интеграции, под стереомикроскопом используйте мундштук аспиратора для преобразования примерно 50 яйцеклеток в каплю м2 среды, покрытую минеральным маслом, которое будет использоваться в качестве камеры впрыска

Перенесите камеру для инъекций в перевернутый микроскоп и введите в оплодотворенные ооциты несколько пиколитров инъекционной смеси. Пронуклеус набухнет, если инъекция прошла успешно. Выполните цитоплазматическую инъекцию для нацеливания на гены, используйте мундштук для переноса примерно 50 яйцеклеток в каплю касома А, содержащую пять микрограммов цитохалазина на миллилитр и инкубируйте яйцеклетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение пяти минут.

Перенесите яйцеклетки в камеру для инъекций, затем при очень низком давлении введите несколько пиколитров инъекционной смеси в цитоплазму. По возможности используйте компенсационное давление автоматического микроинжектора. После инъекции используйте мундштук для переноса ооцитов обратно в каплю казомаминокислот.

Держите их при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока они не будут загружены для повторной имплантации в яйцевод псевдобеременных самок. После обезболивания закупоренной самки мыши согласно текстовому протоколу, для проведения повторной имплантации в стерильных условиях, обнажите репродуктивный тракт с помощью скальпеля на разрез длиной в один сантиметр параллельно дорсальной средней линии. Затем ножницами разрежьте мышцу и с помощью щипцов захватите жировой пакет.

Аккуратно вытяните яичник наружу, пока не станут хорошо видны прикрепленный к нему яйцевод и матка. Затем с помощью зажима для сосудов фиксируют жировую подушку. Под стереомикроскопом с помощью микроножниц сделайте надрез в стенке яйцевода, в нескольких миллиметрах вверх по течению от ампулы.

Также под стереомикроскоп загрузите 25 микровведенных яиц в стеклянный капилляр, соединенный с мундштуком. Затем вставьте стеклянный капилляр в яйцевод и выгоняйте яйца до тех пор, пока внутри ампулы не будет виден пузырь воздуха. Чтобы убедиться в том, что повторная имплантация прошла успешно, необходимо проверить наличие пузырька воздуха в ампуле, который гарантирует, что все яйца были выведены в нужном месте и ни одна из них не осталась в стеклянном капилляре.

Аккуратно удалите стеклянный капилляр и поместите репродуктивный тракт обратно в брюшную полость. Затем используйте три нулевых нерассасывающихся хирургических шва, чтобы зашить разрез, а затем используйте зажимы для раны, чтобы закрыть кожу. Поместите мышь на теплый коврик, чтобы избежать переохлаждения, и введите обезболивающее средство подкожно.

Следите за мышью до полного восстановления. Наконец, проведите типирование и секвенирование генома в соответствии с текстовым протоколом. На этом рисунке показаны аналитические гели, демонстрирующие качество очистки трансгенов и синтез sgРНК, которые имеют решающее значение для успешного получения генетически модифицированных мышей.

Здесь показано типичное чтение сеанса микроинъекции для случайной интеграции. Праймер для генотипирования должен располагаться на трансгене и должен быть спроектирован таким образом, чтобы генерировать фрагмент из 200-800 пар оснований. В этом расшифровке для нацеливания на гены, выбранные праймеры для гибридизации с геномной ДНК за пределами этой области, в конечном итоге были вырезаны двумя парнями.

Эта стратегия позволяет проводить прямую идентификацию гетерозиготных и гомозиготных нокаут-основателей. Как показано здесь, когда каждый шаг протокола оптимизирован, процент трансгенных щенков должен достигать от 10% до 25% для случайной интеграции, что несколько мало по сравнению со способностью компонентов CRISPR редактировать геном мыши. При использовании CRISPR для нацеливания на гены число основателей, как правило, выше, от 25% до 100%.

После своего развития этот метод позволяет исследователям в таких областях, как нейробиология или рак, использовать новые модели масок для обнаружения патологических механизмов и в конечном итоге переводить их в терапевтические стратегии.