Мышь Геном Инжиниринг Использование конструктора нуклеаз

Общая цель этой процедуры заключается в быстром получении мышей с дефицитом генов с помощью дизайнерских хвостовых нуклеаз или когтей. Это достигается путем разработки и сборки конструкций ДНК, кодирующих определенные пары когтей, которые служат шаблонами для транскрипции in vitro для генерации мРНК Talon. Следующим этапом процедуры является выделение оплодотворенных мышиных цитов, а затем микроинъекция их с помощью Т. Последним шагом является хирургический перенос введенных цитов псевдобеременным приемным матерям.

Полученное потомство F zero часто демонстрирует сайт-специфичные делеции геномных последовательностей, которые часто приводят к потере функции гена-мишени. Хотя представленный здесь метод может дать представление о функции генов у мышей, базовый подход также может быть адаптирован к другим модельным организмам, таким как крысы и рыбы. Во-первых, зайдите на веб-сайт, посвященный мишеням эффекторных нуклеотидов TAL.

Выберите программу-мишень TN и вставьте в нее последовательность гена-мишени. Для этого протокола. Используйте семь конструктов экспрессии P-C-A-G-T и набор Talen и T-эффекторов «Золотые ворота», которые доступны для гена AD.

Если для Talen используются другие конструкции или сборочные комплекты, настройки сборки могут отличаться для оптимальной длины прокладки и количества хвостовых автофургонов, выберите опцию Miller Etal 2011 в разделе Использовать предустановленную архитектуру. Затем выберите NN на вкладке Подстановка G. Программа генерирует текстовый файл с потенциальными целевыми сайтами, сформированный из этого списка.

Выберите пару или пары Talen и перейдите к сборке Golden Gate. Этот протокол работает с наиболее часто используемыми лабораторными линиями мышей, включая C 57 BL six J и BDF одну суперовуляцию 10 донорских самок в возрасте четырех недель с использованием внутрибрюшинной инъекции пяти единиц гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы. Через 48 часов дайте самкам пять единиц хорионического гонадотропина человека также путем внутрибрюшинной инъекции сразу после инъекции хорионического гонадотропина человека, самки один к одному с самцами детородного возраста в тот же день, подготовят псевдобеременных приемных матерей. Другие.

На следующее утро принесите в жертву самок и восстановите оплодотворенные яйцеклетки, препарировав их. Затем выпустите ооциты в чашку для культивирования органа, содержащую миллилитр М двух сред. Удалите все кумулюсные клетки, добавив 10 микролитров 0,1%-ного раствора гиалуронидазы крупного рогатого скота в чашку, содержащую клеточные кладки в среде М-2.

Затем с помощью ротовой пипетки промыть эмбрионы через две или три смены М двух сред для удаления гиалуронидазы. Продолжайте лечение гиалуронидазой эмбрионов, которые еще не диссоциировались от кумулюсных клеток. Выделенные эмбрионы могут храниться в среде М 16 при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока они не будут введены в микроинъекции.

Приготовьте 100 микролитров раствора для инъекций, содержащего по 10 нанограмм на микролитр каждого хвоста. Нуклеаза, мРНК, пара и центрифуга в течение 30 минут при 30 000 G до гранул. Любые частицы, которые могут закупорить инъекционные иглы.

Затем держите смесь на льду. Планируйте введение ооцитов на их пронуклеарной стадии в начале дня. Погрузите примерно 100 эмбрионов в М, две среды под слой минерального масла и работайте на инвертированном микроскопе без марсианской оптики ДВС.

При 20-кратном увеличении выберите циты с отчетливыми пронуклеусами. Сортировка ооцитов может быть произведена с помощью пустого инъекционного капилляра, загрузите инъекционный капилляр непосредственно перед его использованием с помощью одного-двух микролитров инъекционного раствора. Затем прикрепите его к головке микровпрыска

Затем аспирируйте выбранный цит с помощью удерживающего капилляра и сделайте неглубокую инъекцию мРНК нуклеазы в цитоплазму. Следует избегать контакта с пронуклеусами. Объем инъекции должен быть низким.

При первых признаках цитоплазматического вздутия извлеките иглу. В норме от 80 до 90% эмбрионов должны выжить без немедленного развития. Чтобы увеличить количество вводимой мРНК, сделайте раствор более концентрированным после микроинъекции имеющихся цитов.

Перенесите их в среду M 16 с помощью ротовой пипетки. Инкубируйте эмбрионы в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Затем переведите тех, кто выжил, в псевдобеременных приемных матерей.

За день до микроинъекции вызвать псевдобеременность у трех-шестимесячных БК одну самку мышей, скрещивая их с секторными самцами VA. На следующее утро выберите самок с прозрачной пробкой для использования в качестве реципиентов эмбрионов. Неиспользованные самки выйдут из своего псевдо-беременного состояния через три недели и могут быть использованы повторно.

Расположите самку приемной матери под наркозом над теплой поверхностью на ее животе. Затем продезинфицируйте область разреза, распылив в нее 70%-ный этанол. Расчешите влажные волосы подальше от запланированного места разреза.

Теперь разрежьте ножницами брюшную полость и выведите наружу маточный рог. Для этого нужно. Потяните за жировую подушку, прикрепленную к яичнику, и обездвижьте репродуктивные органы бульдожьим зажимом.

Кроме того, обязательно поддерживайте органы во влажном состоянии с помощью подогретого 0,9% раствора хлорида натрия. На этом этапе отсортируйте от 12 до 20 жизнеспособных эмбрионов и загрузите их в тонкий стеклянный капилляр. С помощью ротовой пипетки сначала отсасывайте небольшой пузырь воздуха, затем аспирируйте эмбрионы вверх с помощью тонких щипцов.

Аккуратно возьмитесь за UCT прямо перед усилителем и создайте небольшое отверстие в стене UCT с помощью иглы 30 калибра. Вставьте загруженный капилляр в отверстие и осторожно выдувайте эмбрионы в усилитель до тех пор, пока не увидите, что пузырь воздуха был вытеснен из капилляра. Затем удалите капилляр.

Немедленно заместите репродуктивные органы обратно в полость тела и закройте брюшную полость одним швом. Далее закройте кожу с помощью одного или двух девятимиллиметровых зажимов для раны. Верните животное в его домашнюю клетку и наблюдайте за ним, пока анестезия не закончится.

Затем разместите самок в стабильных социальных группах по два-три мыши, чтобы свести к минимуму стресс в течение первых трех послеоперационных дней, обязательно обеспечьте обезболивающим средством, таким как DEF Falcon, в питьевой воде для каждой саранчи в геноме мыши, на которую нацелены дизайнерские нуклеазы. Анализ на основе ПЦР предназначен для идентификации животных-основателей, которые несут желаемый мутировавший аллель. В первом примере литейные аппараты происходят в результате микроинъекции пары хвостовых нуклеаз.

Нацеливание на область оболочки гена мышиного прионного белка анализировали с помощью эндонуклеазного расщепления Т-7 продукта ПЦР. Анализ расщепления эндонуклеазы Т-семи основан на образовании гетеродуплексов между нитями ДНК продуктов ПЦР, полученных из мутировавших аллелей и аллелей дикого типа. Индуцированный талонами мутагенез в целевой области генома одиночных основателей был выявлен появлением 250 и 110 парных продуктов длинного разложения в дополнение к полноразмерному продукту ПЦР.

В качестве альтернативы, продукты ПЦР могут быть подвергнуты рестрикционному расщеплению, если подходящий диагностический сайт рестрикции расположен в области спейсера дизайнерской нуклеазной пары. Во втором примере ZFN нацелен на сайт ограничения XPO one, расположенный во вступлении, один из локусов мыши Rosa 26. Здесь непереваренные полосы указывают на наличие мутаций.

Звездочками обозначено отсутствие каких-либо переваренных продуктов, что убедительно свидетельствует о том, что основатель несет мутации в обоих аллелях целевого гена. Клонирование и секвенирование этих непереваренных продуктов ПЦР показывает, что мыши-основатели могут содержать две или более различных модификаций целевого аллеля. Отсутствие последовательностей дикого типа указывает на полную абляцию гена-мишени.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание конструкции хвостовых нуклеаз, сборки хвоста, нуклеазных конструкций и того, как использовать их для создания мутантных мышей путем прямой микроинъекции озид. Этот метод может быть адаптирован для работы с другими классами дизайнерских нуклеаз, такими как цинк, пальчиковые ядра или CAS nine crispr. Он также может способствовать модификации генома путем гомологичной рекомбинации путем одновременной коинъекции нуклеазы и соответствующего шаблона для нацеливания гена.