Визуализация проекционных паттернов аксонов эмбриональных моторных нейронов у дрозофил

Начните с пробирки, содержащей эмбрионы дрозофилы поздней стадии 16 в монтажной среде.

Моторные нейроны дрозофилы имеют иммунометку.

Перенесите эмбрион на предметное стекло и снимите его с монтажной среды.

Затем поместите эмбрион вентральной стороной вверх и рассеките его.

Ориентируйте передний отдел, содержащий моторные нейроны, тыльной стороной вверх.

С помощью вольфрамовой иглы разрежьте по спинной средней линии и раздвиньте стенку тела. Переместите эмбрион в монтажную среду. Затем удалите внутренние органы, чтобы обнажить помеченные

нейроны.

Перенесите эмбрион на новое предметное стекло, затем установите и запечатайте его.

Наблюдайте под дифференциальным интерференционно-контрастным микроскопом, как свет проходит через эмбрион, создавая изображение с высоким разрешением.

Меченые нейроны с аксональными проекционными узорами выглядят темно-коричневыми на светлом фоне.

Двигательные нейроны разветвляются на два основных нерва: межсегментарный и сегментарный, и второстепенную ветвь, поперечный нерв, который иннервирует мышцы.

Чтобы филировать эмбрионы, поместите их на предметное стекло

Сначала переместите их в каплю глицерина вентральной стороной вверх. Далее под микроскопом вскрытия отрезают переднюю часть на 1 четверть длины тела. И удалите самую заднюю область, которая свободна от моторных аксонов.

Теперь с помощью игольчатого щупа выведите препарат из глицерина, ориентированным тыльной стороной вверх, и расположите его горизонтально в поле зрения. На следующем этапе требуется тонкая вольфрамовая игла, которая была вставлена в полую область игольчатого зонда, а затем согнута на конце. С помощью вольфрамовой иглы сделайте небольшой надрез на заднем конце эмбриона, и продолжайте срезать дорсальную среднюю линию.

Следите за тем, чтобы кончик вольфрамовой иглы не касался поверхности предметного стекла во время вскрытия, потому что игла будет легко пригибаться к стеклу.

Затем с помощью зонда верните препарат обратно в каплю глицерина и расположите его тыльной стороной вверх. Там отделите кишку от стенки тела, развернув каждую стенку тела в вентральном боковом направлении. Две стенки корпуса должны разойтись. Теперь с помощью щупа осторожно переместите створки стенки корпуса на предметное стекло. На предметном стекле с помощью вольфрамовой иглы удалите внутренние органы, толкая их в сторону.

Чтобы стабилизировать вольфрамовую иглу и предотвратить ее повреждение, держите полые игольчатые щупы, удерживающие вольфрамовую иглу, прикрепленными к поверхности предметного стекла во время манипуляций с вольфрамовой иглой.

Теперь смонтируйте препараты и 8 микролитров монтажного раствора на новое предметное стекло. Прикрепите покровное стекло и заклейте края обычным лаком для ногтей. Затем делайте снимки с высоким разрешением с помощью оптики DIC.