Микрофлюидная имитационная проточная цитометрия с помощью асимметричного детектирования оптической микроскопии с временным растяжением (ATOM)

Общая цель данного протокола заключается в подготовке и использовании асимметричной системы оптической микроскопии с растяжением по времени асимметричного обнаружения для высококонтрастной визуализации одиночных клеток без меток в сверхбыстром микрофлюидном потоке. Основное преимущество ATOM заключается в том, что он обеспечивает сверхбыстрый захват изображений со скоростью линейной развертки до десятков мегагерц, одновременно повышая контрастность изображения на непомеченных клетках. ATOM позволяет проводить комплексный морфологический анализ клеточных и субклеточных структур с помощью нецентрированных клеточных анализов со скоростью до 100 000 клеток в секунду, что невозможно при стандартной проточной цитометрии.

Чтобы начать настройку системы, используйте оптоволоконный коллиматор для подключения широкополосного фемто- или пикосекундного импульсного лазера в ближнем инфракрасном диапазоне к одномодовому дисперсионному оптическому волокну, подключенному к оптическому усилителю. Осветите дифракционную градацию пропускания с помощью лазера для создания спектрального дождя. Ориентируйте сортировку близко к конфигурации литтроу, чтобы максимизировать эффективность дифракции.

Сконфигурируйте телескопическую релейную линзу в системе визуализации 4f для направления спектрального потока на заднюю фокальную плоскость объектива под образцом платформы. Убедитесь, что спектральный ливень заполняет заднюю апертуру объектива. Поместите еще одну линзу объектива с плоским зеркалом в заднюю апертуру над платформой образца.

Отрегулируйте линзы объектива так, чтобы их фокальные плоскости перекрывались. Убедитесь, что дважды спектрального потока проходит плоскость изображения и следует по тому же пути обратно к профилированию. Поместите микрофлюидный чип на платформу образца и убедитесь, что спектральный поток падает через микрофлюидный канал.

Перенаправьте отраженный свет с помощью светоделителя после того, как он пройдет через профилирование. Разделите отраженный свет на два луча с помощью другого светоделителя. Используйте оптоволоконные коллиматоры для соединения пучков с одномодовыми волокнами разной длины, чтобы создать временную задержку между лучами.

Подключите волокна к осциллографу реального времени с помощью оптоволоконного соединителя и фотодетектора. Регулируйте усиление оптического усилителя до тех пор, пока отношение сигнал/шум оптического сигнала не станет больше 10 децибел. Затем заблокируйте примерно половину каждого отраженного луча блоками луча с ножевой кромкой.

Регулируйте блоки луча до тех пор, пока измеренная оптическая мощность в каждом волокне не составит примерно половину мощности до блока. Убедитесь, что полоса пропускания и частота дискретизации осциллографа достаточно высоки, чтобы не влиять на разрешение изображения. Для начала эксперимента разбавьте образцы клеток до 10-5-го и 10-6-го клеток на миллилитр фосфатным солевым буфером или родниковой водой.

Затем загрузите клеточный раствор в шприц объемом 10 миллилитров. Подсоедините шприц к входу микрофлюидного канала. Направьте выходное отверстие микрофлюидного канала в центрифужную трубку.

Закрепите шприц в шприцевом насосе и установите скорость потока в соответствии с шириной канала. Выберите количество точек данных, которые будут сохранены для эксперимента. Затем получите и сохраните данные оптического сигнала.

Оцифровывайте и экспортируйте данные с осциллографа на компьютер. Обрабатывайте данные в 2D-изображения и извлекайте из них библиотеку параметров. Импортируйте изображения из библиотеки параметров в программу визуализации.

Назначьте интересующий параметр каждой оси и выберите набор данных, который будет отображаться в виде точечной диаграммы. Проверьте изображения ячеек, связанные с каждой группой на графике, чтобы определить тенденции. При необходимости используйте ручное стробирование или отображайте дополнительные наборы данных для дальнейшего анализа.

ATOM был использован для получения высококонтрастных изображений одноклеточных клеток человека и фитопланктона. Характерные клеточные структуры, такие как вакуоли, пиреноиды и жгутики, видны на изображениях фитопланктона. Такие параметры, как размер и круговость клеток, были определены по изображениям ATOM для классификации клеток для цитометрического анализа.

Результаты классификации могут быть отображены в виде 2D-диаграмм рассеяния. Здесь соотношение объема и окружности было построено для MCF7, показанного желтым цветом, и PBMC, показанного красным. Для MCF7 наблюдались два кластера.

При идентификации высококонтрастных изображений, соответствующих отдельным точкам данных, было обнаружено, что нижний кластер соответствует фрагментам клеток и мусору. После освоения система визуализации может быть настроена за два-три часа, если она выполнена правильно. Процедуры визуализации могут быть проведены в течение часа.

Не забывайте уделять особое внимание безопасности глаз при работе с лазерным источником и юстировке лазерного луча. При выполнении этих процедур всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитных очков. Выполняя эту процедуру, не забывайте следить за выравниванием оптического луча на протяжении всего процесса настройки системы визуализации, чтобы обеспечить оптимальное качество изображения.

В то время как этот метод может дать представление об обнаружении и количественной оценке редких или видимых клеток во время процесса заболевания, он также может быть применен для классификации типов клеток в больших и гетерогенных клеточных популяциях. Этот метод особенно полезен при попытке преодолеть ограничение пропускной способности визуализационной цитометрии при сохранении качества изображения. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как реализовать ATOM от настройки системы до процедур обработки изображений.