Оценка интернализации поверхностных белков-мишеней с использованием производного биотина

Лечите кортикальные астроциты мышей расщепляемым производным биотина.

Инкубируйте при низкой температуре, чтобы предотвратить интернализацию белка и облегчить прикрепление биотина к белкам целевой поверхности.

Промойте и добавьте теплую среду, затем инкубируйте, чтобы вызвать интернализацию биотинилированных белков.

Промойте и обработайте непроницаемым для мембран восстановителем, чтобы расщепить неинтернализованный биотин.

Добавьте закалочный реагент, чтобы остановить реакцию и промойте.

Соберите клетки и центрифугируйте. Удалите надосадочную жидкость.

Добавьте буфер для лизиса для лизиса клеток, высвобождая небиотинилированные и интернализованные биотинилированные белки.

Центрифуга для гранулирования клеточного мусора.

Соберите надосадочную жидкость, содержащую белки, добавьте стрептавидин-агарозные шарики и перемешайте, чтобы захватить биотинилированные белки.

Центрифугой для гранулирования шариков и выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте загрузочный буфер и нагрейте для денатурации и высвобождения белков из гранул.

Нанесите белок на гель и перенесите его на блоттинговую мембрану.

Детектирование с помощью первичных и вторичных антител для визуализации отчетливой полосы белка,