Оценка интернализации поверхностных белков-мишеней с использованием производного биотина

Лечите кортикальные астроциты мышей расщепляемым производным биотина.

Инкубируйте при низкой температуре, чтобы предотвратить интернализацию белка и облегчить прикрепление биотина к белкам целевой поверхности.

Промойте и добавьте теплую среду, затем инкубируйте, чтобы вызвать интернализацию биотинилированных белков.

Промойте и обработайте непроницаемым для мембран восстановителем, чтобы расщепить неинтернализованный биотин.

Добавьте закалочный реагент, чтобы остановить реакцию и промойте.

Соберите клетки и центрифугируйте. Удалите надосадочную жидкость.

Добавьте буфер для лизиса для лизиса клеток, высвобождая небиотинилированные и интернализованные биотинилированные белки.

Центрифуга для гранулирования клеточного мусора.

Соберите надосадочную жидкость, содержащую белки, добавьте стрептавидин-агарозные шарики и перемешайте, чтобы захватить биотинилированные белки.

Центрифугой для гранулирования шариков и выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте загрузочный буфер и нагрейте для денатурации и высвобождения белков из гранул.

Нанесите белок на гель и перенесите его на блоттинговую мембрану.

Детектирование с помощью первичных и вторичных антител для визуализации отчетливой полосы белка, подтверждающей успешную интернализацию белка.

Сначала извлеките культуры астроцитов из инкубатора и аспирируйте среду. Затем трижды промойте клетки 4 миллилитрами охлажденного CM-PBS и поставьте посуду на колотый лед. Аспирируйте CM-PBS, а затем пипеткой внесите 3 миллилитра биотинового буфера в каждую чашку. Наклоните посуду вперед и назад несколько раз, чтобы убедиться, что буфер хорошо распределен, и оставьте ее на льду на 30 минут.

Затем аспирируйте биотиновый буфер и замените его 5 миллилитрами теплой среды. Одну чашку для культуры инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, а вторую чашку при той же температуре в течение 30 минут. Оставьте другую чашку при температуре 4 градуса Цельсия в качестве образца нулевой минуты.

В конце инкубационного периода выбросьте среду и трижды промойте клетки 4 миллилитрами охлажденного CM-PBS. После этого аспирируйте CM-PBS, а затем пипеткой нанесите 6 миллилитров восстановительного буфера на клетки и оставьте образец на льду на 15 минут.

Затем замените среду 6 миллилитрами свежего восстановительного буфера и поместите образец на лед еще на 15 минут.

Этот шаг имеет решающее значение, так как глутатион, содержащийся в восстановительном буфере, расщепляет остатки биотина, оставшиеся на поверхности клетки. Это гарантирует, что только интернализованные белки будут смещены и помечены.

После этого удалите восстановительный раствор и замените его 6 миллилитрами закалочного буфера. Оставьте образец на льду еще на 15 минут и повторите этап закалки еще раз. Затем выбросьте буфер для гашения и трижды промойте клетки 4 миллилитрами охлажденного PBS.

Отсадите CM-PBS, а затем соскребите клетки в 1 миллилитр охлажденного PBS с помощью клеточного подъемника и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку. Гранулируйте клетки центрифугированием при 100 г в течение трех минут. Через три минуты выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах буфера для лизиса.

Оставьте образец на льду на 30 минут и делайте вихрь каждые пять минут. Центрифугируйте лизат при 14 000 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы гранулировать моющее средство и растворимые вещества. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку.

С помощью отрезанного наконечника пипетки добавьте в лизат 150 микролитров кашицы агарозы стрептавидина и выдерживайте его при температуре 4 градуса Цельсия в течение трех часов в шейкере. Через три часа гранулы стрептавидина с агарозой методом центрифугирования при 1500 г в течение 30 секунд при температуре 4 градуса Цельсия. Суспензируйте бусины в 1 миллилитре буфера для стирки и раскачивайте их в течение трех минут при температуре 4 градуса Цельсия. Гранулируйте шарики и выбросьте надосадочную жидкость.

Повторите этот процесс еще четыре раза, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание небиотинилированных цитозольных белков. Затем гранулируйте шарики центрифугированием при 1500 г в течение 30 секунд при температуре 4 градуса Цельсия. Выбросьте вышележащий буфер для стирки и добавьте 50 микролитров 1x загрузочного буфера.

Высвобождают биотин и стрептавидин из гранул путем денатурации при 95 градусах Цельсия. Эта фракция должна содержать только интернализованные белки клеточной поверхности. Затем разделите вход, поверхность клетки и несвязанные дроби с помощью SDS-PAGE и проанализируйте с помощью вестерн-блоттинга.