Корреляционные суперразрешением и электронной микроскопии решить локализация белка в Zebrafish сетчатки

Этот протокол описывает необходимые шаги для получения результатов локализация внутриклеточных белков на сетчатке данио рерио, соотнося суперразрешением светлую микроскопию и сканирование электронной микроскопии изображений.

Общая цель этого метода микроскопии заключается в точной локализации экспрессии белка по отношению к различным субклеточным органеллам в сетчатке личинки данио-рерио путем корреляции изображений сверхвысокого разрешения и сканирующей электронной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития сетчатки и клеточных путей, такие как изучение неправильной локализации белка у мутантов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он сочетает в себе сверхвысокое разрешение со сканирующей электронной микроскопией для получения высокоточных данных о локализации белка в структурном контексте образца.

Коллекция секций Токуясу на силиконовых пластинах существенно облегчает обращение, а использование платинового затенения для контраста обеспечивает хорошую топографию образца. Таким образом, этот метод может дать представление об исследованиях сетчатки личинок рыбок данио. Одним из его основных преимуществ является то, что он также может быть применен ко многим другим биологическим системам, таким как идентификация экспрессии белка в тканях мыши.

После вскрытия глаз у неподвижных личинок данио-рерио согласно текстовому протоколу разогрейте 15 миллилитров 12%-ного желатина местной пищевой марки в PBS при 40 градусах Цельсия. Затем отсасывайте PBS из трубок глаз и добавьте раствор желатина. Осторожно постучайте по пробирке, чтобы убедиться, что желатин проникает в образец, и инкубируйте его в течение 10–30 минут при температуре 40 градусов Цельсия в термоблоке с легким встряхиванием или на водяной бане.

На водяной бане при температуре 40 градусов Цельсия заполните силиконовые или полиэтиленовые плоские формы для заделки 12 на пять на три миллиметра теплым желатином. Затем с помощью пипетки добавьте по два глаза на форму, а под бинокль с помощью иглы для пресечения правильно выровняйте их. Дав желатину остыть при комнатной температуре в течение одной минуты, поместите его при температуре четыре градуса Цельсия на 20 минут для застывания.

Под биноклем используйте бритвенное лезвие, чтобы повторно обрезать желатиновый блок так, чтобы он подходил по одному глазу на блок. Перенесите вложенный желатин глаз в 2,3 моляра сахарозы в PBS на льду. Инкубируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

Затем обменяйте образцы на свежий 2,3 молярного раствора сахарозы. И храните ткань при температуре четыре градуса Цельсия, или минус 20 градусов Цельсия для хранения до нескольких месяцев. Снова обрежьте желатиновый блок почти до размера глаза, прежде чем перенести его на крио-штифт.

Затем заморозьте блок в жидком азоте, и перенесите его в крио-ультрамикротом. С помощью алмазного ножа в крио-ультрамикротоме вырезают участки толщиной 110 нанометров при температуре минус 120 градусов Цельсия. Подберите срезы с проволочной петлей, содержащей каплю 2% метилцеллюлозы и 2,3 моляра раствора сахарозы.

Затем переложите срезы на силиконовую пластину размером семь на семь миллиметров. Чтобы промыть, наберите четыре капли пипеткой и положите пластины вверх дном на капли. Инкубируйте на каплях при нулевом угле градусов Цельсия в течение 20 минут.

Затем промойте два раза в PBS при комнатной температуре по две минуты каждая. Инкубируйте образцы три раза в 0,15% глицине в PBS в течение одной минуты каждый. Затем используйте PBS для промывки образцов три раза по одной минуте за промывку.

Предварительно инкубируйте ткань с PBG в течение пяти минут. Далее добавляем в разделы кролика анти-Том20 в ПБГ. И инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

С помощью PBG стирайте салфетку шесть раз по одной минуте за одну стирку. Затем предварительно инкубируйте образцы с ПБГ при комнатной температуре в течение пяти минут. Замените PBG на фрагменты Alexa 647 anti-rabbit divalent Fab в PBG и инкубируйте в течение 30 минут.

Промойте образцы в PBG шесть раз по одной минуте за промывку. Затем используйте PBS, чтобы промыть три раза в течение двух минут. Добавьте DAPI и PBS в пластины и инкубируйте в течение 10 секунд.

Затем используйте PBS для промывки образцов два раза по две минуты каждый. Поместите пластину на каплю раствора 80% глицерина и буфера для визуализации, содержащего систему очистки кислорода, и кратковременно инкубируйте ее. Переложите пластины тканевой стороной вниз на свежую каплю смеси 80% глицерина и буфера для визуализации один к одному на чашке Петри со стеклянным дном.

Используйте пипетку со всех сторон, чтобы удалить большую часть жидкости из-под пластины. Затем с помощью силиконовых полосок закрепите на дне чашки Петри. Поместите смонтированные срезы на инвертированный микроскоп с масляным иммерсионным объективом с высокой числовой апертурой.

Перед получением изображения дайте образцу сбалансироваться в соответствии с температурой микроскопа, чтобы свести к минимуму или уменьшить боковой и аксиальный дрейф. Центрируйте область интереса и получайте широкопольные эпифлуоресцентные эталонные изображения. Переход в режим работы со сверхвысоким разрешением.

Отрегулируйте время экспозиции камеры на 15 миллисекунд и установите усиление, умножающее электроны, на максимальное значение 300. Затем подсветите образец в эпифлуоресцентном режиме с помощью лазера с яркостью 642 нанометра при максимальной мощности лазера. Как только мигание одной молекулы будет хорошо разделено в каждом кадре, так что вероятность того, что отдельные сигналы будут перекрываться, будет низкой, мощность лазера уменьшится почти до 1/3.

Запишите необработанное изображение в эпифлуоресцентном режиме, получив минимум 30 000 кадров. На основе необработанных данных в разделе «Инструменты» анализ t-Series использует порог обнаружения 30 фотонов. Нажмите кнопку Оценить, чтобы создать список событий локализации.

В разделе «Инструменты» на панели «Обработка списка событий» нажмите «Создать изображение», чтобы визуализировать изображение со сверхвысоким разрешением с помощью гауссова аппроксимации, применяя размер пикселя рендеринга в четыре нанометра. Удалите силиконовые полоски и добавьте каплю PBS близко к краям, чтобы поднять ее вверх от чашки Петри. После использования PBS для промывки пластины два раза по две минуты каждый, используйте 0,1% глутаральдегид в PBS для последующего закрепления в течение пяти минут.

Затем снова промойте образец два раза по две минуты за промывку в PBS. Инкубируйте пластину по одной капле 2%-ной метилцеллюлозы в воде на льду два раза в течение пяти минут за инкубацию. Затем вставьте пластину в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 14, 100 раз g в течение 90 секунд.

После отжима используйте проводящий углеродный цемент для крепления пластины на алюминиевую заглушку SEM. С помощью электронно-лучевого испарителя добавьте слой от двух до 10 нанометров платинового углерода на образец путем ротационного затенения со следующими настройками. Срезы изображения с помощью сканирующего электронного микроскопа с напряжением 1,5 киловольта, рабочим расстоянием два миллиметра и с помощью внутрилинзового детектора вторичных электронов.

Используйте Fiji для открытия изображений с помощью световой и электронной микроскопии, нажав «Файл», «Открыть». Отрегулируйте размер холста, нажав «Изображение», «Настроить», «Размер холста». Затем сведите оба изображения в стопку, нажав «Изображение», «Стопки», «Изображения в стопку».

На Фиджи откройте интерфейс нового трека EM2, нажав Файл, Новый, Трек EM2 новый. Импортируйте стопку с обоими изображениями, щелкнув правой кнопкой мыши по черному окну и выбрав «Импортировать стопку». Совместите изображение световой микроскопии с изображением электронной микроскопии вручную по ориентирам, щелкнув правой кнопкой мыши по изображению и выбрав «Выровнять, выровнять слой вручную по ориентирам».

Выберите инструмент Выбрать для добавления ориентиров. Используйте форму ядер в качестве образца, чтобы выбрать одинаковые края на обоих изображениях и добавить несколько точек. Примените выравнивание по аффинной модели, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав Применить преобразование, Аффинная модель.

Наконец, измените прозрачность слоя, чтобы оценить качество выравнивания. На этой панели показано широкоугольное изображение с малым увеличением на срезе сетчатки данио-рерио через пять дней после оплодотворения. Та же область показана здесь с помощью сканирующей электронной микроскопии.

На этих изображениях с большим увеличением видно, что Tom20 окрашивается в красный цвет с кластерами в митохондриях. Здесь показана экспрессия Tom20 в том виде, в каком она была обнаружена с помощью микроскопии GSDIM. На этом изображении тот же раздел сочетает в себе корреляционную сверхразрешающую и сканирующую электронную микроскопию.

Окрашивание Tom20 появляется в митохондриальном кластере на внешних мембранах митохондрий. Флуоресцентный сигнал DAPI в ядрах соответствует топографии СЭМ-изображения. Это изображение SEM предоставляет контекст для окрашивания Tom20 на изображении GSDIM.

Хорошо видны митохондриальные кристаллы, а окрашивание Tom20 локализуется на наружных мембранах митохондрий. Мембраны наружного сегмента фоторецепторов четко рассасываются. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости как можно лучше оптимизировать параметры маркировки и визуализации.

Только оптимально помеченные образцы подходят для сверхвысокого разрешения. Образцы ни в коем случае не должны высыхать во время процедуры маркировки. Эта процедура может быть расширена до иммунофлуоресценции с двойным мечением и, таким образом, позволяет локализовать два различных белка в определенной структуре.

В случае более сложных образцов рекомендуется использовать реперные знаки для получения точного выравнивания изображений. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить корреляционные исследования для локализации белков по отношению к различным органеллам клетки в сложном образце ткани со сверхвысокой точностью.