Микроскопия на основе методов для оценки миграции эпителиальных клеток во время в Vitro заживление ран

Общей целью этих процедур искусственного ранения эпителиальных клеточных культур является изучение миграции клеток как с количественной, так и с качественной точки зрения, что позволяет оценить влияние конкретных методов лечения на заживление ран. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области заживления ран, поскольку он позволяет точно охарактеризовать роль конкретных миграционных процессов во время разрушения эпителия. Основное преимущество этого подхода заключается в том, что он позволяет коррелировать измерения миграции клеток с изменениями в поведении соответствующих молекулярных маркеров.

Применение этих методов распространяется на терапию клинических ран, поскольку они предлагают удобную установку для раннего тестирования лекарств и для закрытия раны. Как правило, к этому методу приступают из-за трудностей в получении устойчивой воспроизводимости в ранах с поколения. Для проведения анализа на царапину искусственной раны начните с засеивания каждой лунки культуральной пластины двумя миллилитрами эпителиальных клеток, представляющих интерес в полной среде.

Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение двух-трех дней до 100% конфлюенции. Когда клетки будут готовы, промойте их два раза свежей средой, не содержащей сыворотки, а затем в течение 24 часов культивируйте ее в свежей среде, не содержащей сыворотки. На следующий день поместите планшет в стерильную рабочую зону и дважды протащите узкий конец стерильного наконечника микропипетки по дну каждой лунки, чтобы получить крестообразную рану.

Равномерный зазор между ранами достигается за счет приложения постоянного, сильного давления при плавном перемещении кончика по поверхности эпителия. Чрезмерное давление приведет к деформации наконечника, что приведет к неравномерному радиусу раны. Аккуратно удалите надосадочную жидкость, чтобы избавиться от оторвавшихся клеток, и осторожно добавьте в лунки свежую среду без сыворотки.

Используя инвертированный фазово-контрастный микроскоп, подключенный к камере устройства с зарядовой связью, совместите край поля микроскопа с прилегающим пересечением царапин, чтобы получить до четырех эталонных изображений промежутка царапин в каждой лунке. Когда все изображения будут получены, замените среду в предназначенных для обработки лунок свежей средой, дополненной выбранными процедурами, представляющими интерес, и верните планшеты в инкубатор для клеточных культур. Когда хотя бы одно состояние достигнет примерно 90% закрытия царапин, аккуратно замените надосадочную жидкость одним миллилитром четырехпроцентного формалина в PBS на 15-минутную инкубацию при комнатной температуре.

Затем аккуратно промойте клетки PBS не менее трех раз, чтобы удалить избыток формалина, и визуализируйте лунки так, как только что было продемонстрировано, используя те же параметры визуализации в исходных эталонных областях, зафиксированных после царапины. Чтобы проанализировать изображения с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений, откройте интересующее вас изображение, записанное до обработки, и в меню Изображение установите тип изображения на 8-разрядный. В меню Процесс выберите подменю Фильтры и примените фильтрацию Отклонения.

В меню «Изображение» откройте подменю «Настройка» и установите значение «Порог» на черно-белое. В меню «Процесс» выберите подменю «Двоичный» и примените «Заполнить дыры». В меню Анализ выберите Задать измерения и активируйте Область.

Затем нарисуйте измеряемую область, следуя контуру мигрирующей кромки, чтобы разграничить зазор. В меню Анализ выберите пункт Анализ частиц и запишите общие значения площади для поверхности нарисованной области. Чтобы количественно оценить абсолютную миграцию для каждого набора отдельных образцов в виде разницы между измерениями поверхности зазора, экспортируйте значения общей площади поверхности зазора до и после обработки в электронную таблицу и постройте график результатов количественного анализа.

Для анализа искусственного миграционного фронта в стерильных условиях добавьте один слой до 33 стерилизованных круглых покровных стекол в пустые 10-сантиметровые культуральные планшеты. Когда поверхность планшета будет полностью покрыта, осторожно засейте интересующие эпителиальные клетки в концентрации, обеспечивающей 100% слияние после двух или трех дней культивирования. При необходимости аккуратно надавите на покровные глотки стерильным наконечником микропипетки, чтобы предотвратить всплывание.

Когда клетки достигнут слияния, замените надосадочную жидкость на бессывороточную среду еще на 24 часа посева. Затем с помощью стерильных пинцеров осторожно переложите одну покровную салфетку в новую 10-сантиметровую пластину, содержащую свежую среду без сыворотки, стараясь удерживать покровную салфетку по ее периферии. Чтобы создать искусственные раны, проведите стерилизованным лезвием бритвы вперед и назад по каждому покровному стеколе, чтобы сделать поперечную линию в три-четыре миллиметра над центром каждой клеточной культуры, чтобы полностью удалить центральную монослойную полосу.

Позаботьтесь о том, чтобы лезвие бритвы плотно расположилось по поверхности покровного стекла при нанесении раны, чтобы предотвратить неправильную форму края и образование отвисших эпителиальных частей. Переложите до четырех покровных листов для раны клеткой вверх в отдельные лунки шестилуночного планшета, содержащего не менее двух миллилитров бессывороточной среды, и аккуратно промойте каждую лунку два раза свежей средой, не содержащей сыворотки, чтобы удалить любые отслоившиеся клетки. Когда все отделенные клетки будут отброшены, аккуратно замените промывочную среду свежей средой, дополненной интересующей обработкой, и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур.

В конце соответствующего экспериментального периода зафиксируйте клетки четырехпроцентным формалином в PBS, как показано выше, и окрашивайте клетки соответствующими флуоресцентными конъюгированными антителами, представляющими интерес. Затем визуализируйте структурные изменения, происходящие на мигрирующем переднем крае, с помощью флуоресцентной микроскопии в соответствии с интересующими экспериментальными параметрами. В этом эксперименте раневые промежутки были измерены до и после лечения эпидермальным фактором роста, хорошо известным индуктором пролиферации и миграции эпителиальных клеток.

Затем абсолютная миграция рассчитывалась как разница между площадями поверхности зазора до и после обработки. Лечение эпидермальным фактором роста потенцирует цитоскелетную динамику клеток, что наблюдается на этих изображениях лазерной сканирующей микроскопии, окрашивании F-актином контрольных и стимулированных фактором роста клеток. Кроме того, наблюдается сверхэкспрессия c-Jun с повышенной экспрессией белка, видимой в клетках, прилегающих к мигрирующему фронту.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать проверять целостность краев раны на наличие лоскутов эпителиальных клеток, которые могут нарушить количественную оценку миграции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как количественно и качественно оценивать миграционное поведение