Подготовка образцов и изображений Exosomes, просвечивающей электронной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за морфологией очищенных внеклеточных везикул и выполнении специфической локализации белка во внеклеточных везикулах с помощью электронной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы периода исследования внеклеточных везикул, такие как категоризация экзосомы и специфических белков, расположенных внутри нее. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с ее помощью можно наблюдать за порцией специфических белков, расположенных как внутри, так и снаружи экзосомы.

Применение этого метода заключается в обеспечении диагностики нескольких заболеваний, включая рак и бактериальные инфекции. Хотя этот метод может дать представление об экзосоме, он также может быть применен к другим биологическим образцам, микроклеточной инкубации и локализации специфических белков. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за контаминации при неспецифическом связывании частиц иммунозолота.

Используя стандартные методики, готовят экзосомы в культуре. Затем ультрацентрифугирование супернатанта культуры клеток HCT116 для гранулирования экзосом из среды. После гранулирования осторожно удалите надосадочную жидкость культуры.

Чтобы закрепить очищенную гранулу экзосомы, добавьте один миллилитр 2,5%-ного глутаральдегида в 0,1 молярный раствор какодилата солдиума при PH 7,0. Инкубируйте липидные пузырьки в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия. Далее снимите фиксатор и промойте гранулы одним миллилитром 0,1 молярного буферного раствора какодилата натрия при комнатной температуре в течение 10 минут.

Затем добавьте в образцы один миллилитр 2%-ного тетраоксида осмия на один час при температуре четыре градуса Цельсия. Снимите фиксатор и трижды промойте гранулу экзосомы с 0,1 молярного какодилата натрия, меняя буфер каждые десять минут. Затем обезвожьте образец, встряхивая его в течение 10 минут каждый в серии дифференцированных концентраций ацетона.

Далее смешайте раствор из трех частей ацетона и одной части заделочной смеси с низкой вязкостью. Замените этой смесью ацетон и выдержите образец в течение 30 минут. Продолжайте увеличивать соотношение маловязкой закладочной среды, инкубируя в течение 30 минут с каждым этапом.

Наконец, инкубируйте гранулу экзосомы в 100% смеси для встраивания с низкой вязкостью в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день погрузите образец в чистую смесь для заделки с низкой вязкостью с помощью закладной формы и запекайте его в течение 24 часов при температуре 65 градусов Цельсия. С помощью ультрамикротома подготовьте срезы толщиной 60 нанометров.

Поместите срезы на никелевую сетку и дважды покрасьте некоторые из них 2% уранилацетатом в течение 20 минут, а затем цитратом свинца в течение 10 минут. Затем поместите окрашенный срез в просвечивающий электронный микроскоп и просмотрите образец с помощью 80 киловольт и следуйте автоматическим настройкам времени экспозиции. Имея в виду изображение экзосомы, получите и сохраните изображение с помощью программного обеспечения микроскопа.

Для начала инкубируйте сетки, содержащие неокрашенные участки толщиной 60 нанометров, в каплях 0,02 моляра глицина объемом 50 микролитров в течение 10 минут, чтобы погасить свободные альдегидные группы. Затем промойте срезы в 100 микролитрах дистиллированной воды три раза по 10 минут каждая. После последнего промывки инкубируйте секции в течение одного часа при комнатной температуре в PBS, содержащем 1% BSA.

Затем инкубируйте сетки в 50-100 микролитровых каплях антитела против KRS в течение одного часа. Далее промойте сетки пять раз по 10 минут каждая в капле PBS, содержащей 0,1% BSA. Затем перенесите сетки в каплю соответствующего вторичного антитела и инкубируйте срезы в течение одного часа при комнатной температуре.

Теперь промойте решетки пять раз в течение 10 минут, каждый раз с отдельной каплей PBS, содержащей 0,1% BSA. Дважды окрашивайте срезы 2%-ным уранилацетатом в течение 20 минут в темноте, а затем цитратом свинца Рейнольдса в течение 10 минут. Поместите окрашенный срез в просвечивающий электронный микроскоп и посмотрите на образец с помощью 80 киловольт и сфотографируйте его, как показано ранее.

Чтобы выполнить негативное окрашивание, зафиксируйте очищенные экзосомы после выделения одним миллилитром 2% параформальдегида в течение пяти минут. Обработайте тонкие, покрытые формваром/углеродной пленкой, 200 меш, медные ЭМ-решетки тлеющим разрядом в течение одной минуты, затем загрузите пять-семь микролитров раствора экзосомной суспензии на сетку и инкубируйте ее в течение одной минуты. Если концентрация экзосомы слишком высока, разбавьте концентрацию до соответствующего уровня.

Немедленно окрашивайте экзосомы примерно 20 каплями отфильтрованного 1%-ного раствора уранилацетата на поверхность ЭМ-сетки. Удалите излишки раствора уранилацетата из сетки, соприкоснувшись с краем решетки фильтровальной бумагой, затем быстро промойте сетку каплей воды. С помощью пинцета поместите сетку на стол и частично накройте сетку чашкой для культуры.

Дайте сетке высохнуть в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем сделайте снимок сетки или сохраните ее в коробке для электронного микроскопа для будущих наблюдений. Начните с обработки тонких медных электромагнитных сеток с покрытием формвар/углеродная пленка 200 меш с тлеющим разрядом в течение 30 секунд. Затем загрузите пять-семь микролитров экзосом, зафиксированных в 2% растворе параформальдегида, на решетку и инкубируйте их там в течение пяти минут.

Далее промойте экзосомы 100 микролитрами PBS, три раза каждая в течение 10 минут. Обработайте сеточки, содержащие экзосомы, 50 микролитрами 0,5 молярного раствора глицина в течение 10 минут для гашения свободных альдегидных групп. Затем перенесите сетки в каплю PBS, содержащую 1% BSA, и заблокируйте на 30 минут.

Теперь инкубируйте сетки с 50-100 микролитрами антител против PD-L1 в течение одного часа при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Промойте сетку пятью отдельными каплями PBS, содержащей 0,1% BSA, в течение 10 минут каждая, затем перенесите сетку на каплю вторичного антитела на один час. Затем промойте решетку пятью отдельными каплями PBS, содержащими 0,1% BSA, в течение 10 минут каждая, затем промойте решетку двумя отдельными каплями дистиллированной воды.

Когда закончите, выполните негативное окрашивание 2%-ным уранилацетатом, как было показано ранее, и сфотографируйте образцы или сохраните их в коробке с электромагнитной сеткой для будущих наблюдений. Наблюдаемая здесь морфология экзосом является продуктом негативного окрашивания. Эти экзосомы демонстрируют типичную чашеобразную морфологию, которая является артефактом, который может возникнуть в процессе сушки.

Дополнительная информация может быть получена с помощью окрашивания всем маунтом иммунозолота, например, о расположении конкретных белков в экзосоме. Здесь белыми стрелками обозначено местоположение PD-L1. На разрезанных изображениях везикулы показали просветную структуру, известную как структурная особенность экзосом.

Они также могут быть окрашены иммунозолотом для идентификации специфических белков во всех экзосомах. После освоения техника окрашивания иммунозолотом может быть выполнена в фиброзных клетках после простой подготовки и разрезания, если она выполнена правильно. После этой процедуры может быть выполнен другой метод, такой как двойное иммуноокрашивание, для одновременной идентификации местоположения двух разных белков.

После каждой разработки этот метод может быть использован в области внеклеточных везикул для изучения диагнозов заболеваний при биопсии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как определить конкретную локализацию белка в экзосоме. Не забывайте, что они работают с фиксирующими растворами, такими как хлоргидрат, параформальдегид и тетраоксид осмия, которые могут быть чрезвычайно опасными, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как вентилируемый вытяжной шкаф и латексные перчатки.