Выделение и профилирование микроРНК содержащих экзосомы от человека Bile

Общая цель этого метода заключается в выделении экзосом из человеческой желчи для дальнейшего анализа, включая профилирование микроРНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области заболеваний печени, такие как обнаружение определенного маркера желчи для холангиокарциномы или других заболеваний желчевыводящих путей. Основное преимущество этой техники заключается в том, что она надежна и повторяема.

Для проведения эндоскопической ретроградной холангиопанкреатографии, или ЭРХПГ, начните с положения пациента на спине. После интубации и пропускания дуоденоскопа через рот пациента введите его во вторую часть двенадцатиперстной кишки и определите главный сосочек. Селективно канюлируйте общий желчный проток, вставив трехпросветный сфинктеротом, предварительно нагруженный гидрофильным проводником диаметром 0,35 дюйма или 0,9 миллиметра.

Под рентгеноскопическим контролем проведите проводник к левому печеночному протоку, затем продвинуте сфинктеротом на пять сантиметров в желчный проток, чтобы приобрести стабильное положение. После снятия проводника прикрепите 10-миллиметровый шприц к порту проводника через нижний замок и используйте 10 миллилитров отрицательного давления для аспирации желчи. Извлеките шприц, содержащий желчь, и после повторного введения проводника введите контрастное вещество через порт для инъекции, чтобы помутнить желчевыводящее дерево.

Затем переложите собранную желчь в 15-миллилитровую пробирку на льду и, если хранение на более позднее время, центрифугируйте образец при 500-кратном g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут перед замораживанием при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы немедленно приступить к выделению экзосом, перелейте 400 микролитров желчи в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте при 300-кратном g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут для сбора клеток и клеточного мусора. Чтобы еще больше удалить надосадочную жидкость, переложите раствор в свежие микроцентрифужные пробирки и центрифугируйте образцы при 16, 500 g и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.

Затем в шкафу биобезопасности соберите надосадочную жидкость в шприц и отфильтруйте ее через мембранный фильтр из полиэфирсульфона толщиной 0,2 микрометра, чтобы удалить любые оставшиеся частицы размером более 200 нанометров. Перенесите отфильтрованную надосадочную жидкость в ультрацентрифужные пробирки и используйте PBS, чтобы заполнить пробирки как минимум на две трети, чтобы предотвратить схлопывание пробирок во время центрифугирования. Гранулируйте экзосомы через ультрацентрифугирование при 120, 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение 70 минут.

Маленькая желтая гранула будет содержать экзосомы. Выбросьте надосадочную жидкость, тщательно сцедив и продезинфицировав отходы, добавив отбеливатель до конечной концентрации 10% объема на объем. Затем дайте постоять 20 минут.

Для последующих экспериментов либо обрабатывайте гранулы в небольшом объеме подходящего раствора, либо повторно суспендируйте их в 50-100 микролитрах PBS и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия для использования в будущем. После подготовки сеток из окрашенных контрастом внеклеточных везикул, или ВВ, согласно текстовому протоколу, получить изображения с помощью электронного микроскопа с использованием ускоряющего напряжения 80 киловольт, начиная с увеличения 20 000 Х, и увеличивая до 100 000 Х, при определении размера частиц. Экзосомы слишком малы, чтобы их можно было обнаружить с помощью обычной микроскопии или проточной цитометрии; однако на этом рисунке показаны результаты типичного анализа отслеживания наночастиц (NTA) экзосом, который измеряет концентрацию и распределение по размерам, которое в среднем составило 97 нанометров в этом изолированном образце человеческой желчи.

Электронная микроскопия также может быть использована для подтверждения размера выделенных частиц в человеческой желчи, и этот рисунок показывает типичный результат пропускающей ЭМ. Эти вестерн-блоттинги были исследованы на наличие белков, обогащенных экзосомами, такими как тетраспанин CD63 и Tsg101. На этом графике амплификации в реальном времени показаны различные виды микроРНК, извлеченные из экзосом человеческой желчи.

Поскольку экзосомы не имеют надежных стандартов, таких как 18S или 28S рибосомальная РНК или гены домовладельца, спайкинг синтетической микроРНК важен для нормализации. Метод выделения экзоса может быть выполнен за три часа, если он выполнен правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получать и обрабатывать желчь у пациентов или животных для выделения и анализа внеклеточных везикул.

При отказе от этой процедуры важно помнить о центрифугировании образца при 500 G и четырех градусах перед замораживанием при минус 80, если вы не можете продолжить ультрацентрифугирование. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как исследования микроРНК, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как профили микроРНК. Не забывайте, что работа с желчью может быть чрезвычайно опасной, так как она может содержать гепатит, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и защитных очков.

После своего развития этот метод проложил путь к исследованиям в области изучения холангиокарциномы для изучения внеклеточных везикул в качестве потенциального биомаркера в желчи у пациентов с проблемами желчевыводящих путей, такими как обструкция ПСА.