Выделение и профилирование микроРНК содержащих экзосомы от человека Bile

Общая цель данного метода заключается в выделении экзосом из желчи человека для последующего анализа, включая профилирование микроРНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области заболеваний печени, такие как обнаружение специфического маркера желчи для холангиокарцином или других заболеваний желчевыводящих путей. Основным преимуществом данной методики является ее надежность и воспроизводимость.

Для проведения эндоскопической ретроградной холангиопанкреатографии (ЭРХПГ) сначала поместите пациента в положение лежа на спине. После интубации и проведения дуоденоскопа через рот пациента введите его во вторую часть двенадцатиперстной кишки и найдите большой сосочек. Выполните селективное канюлирование общего желчного протока, введя трехпросветный сфинктеротом с предварительно установленным гидрофильным проводником диаметром 0.35-inch или 0.9-millimeter.

Под флюороскопическим контролем проведите проводник в левый печеночный проток, затем введите сфинктеротом на пять сантиметров в желчный проток для достижения стабильного положения. После извлечения проводника присоедините шприц объемом 10 мл к порту для проводника через нижний замок и с помощью отрицательного давления в 10 мл аспирируйте желчь. Извлеките шприц с желчью и, повторно введя проводник, введите контрастное вещество через инъекционный порт для визуализации желчевыводящих путей.

Затем перенесите собранную желчь в пробирку объемом 15 мл на лед; если образец предназначен для последующего использования, центрифугируйте его при 500 ×g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут перед замораживанием при минус 80 градусах Цельсия. Для немедленного выделения экзосом перенесите 400 µL желчи в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте при 300 ×g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут для осаждения клеток и клеточного дебриса. Для дальнейшей очистки супернатанта перенесите раствор в новые микроцентрифужные пробирки и центрифугируйте образцы при 16 500 ×g и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.

Затем в боксе биологической безопасности соберите супернатант в шприц и профильтруйте его через полиэфирсульфоновый мембранный фильтр с порами 0.2 µm, чтобы удалить все оставшиеся частицы размером более 200 nm. Перенесите отфильтрованный супернатант в пробирки для ультрацентрифугирования и добавьте PBS так, чтобы пробирки были заполнены как минимум на две трети; это необходимо для предотвращения деформации пробирок при центрифугировании. Осадите экзосомы путем ультрацентрифугирования при 120,000 ×g и 4 °C в течение 70 минут.

Экзосомы будут находиться в виде небольшого желтого осадка. Удалите супернатант путем осторожного декантирования и продезинфицируйте отходы, добавив отбеливатель до конечной концентрации 10% по объему. Затем оставьте раствор на 20 минут.

Для последующих экспериментов либо обработайте осадки в небольшом объеме подходящего раствора, либо ресуспендируйте их в 50–100 µL PBS и храните при температуре -80 °C для дальнейшего использования. После подготовки сеток с экстрацеллюлярными везикулами (EV), окрашенными контрастным красителем согласно текстовому протоколу, получите изображения с помощью электронного микроскопа при ускоряющем напряжении 80 kV, начиная с увеличения 20 000 X и увеличивая его до 100 000 X при определении размера частиц. Экзосомы слишком малы для обнаружения с помощью обычной микроскопии или проточной цитометрии; однако на данном рисунке представлены результаты типичного анализа трекинга наночастиц (NTA) экзосом, который определяет концентрацию и распределение по размерам, средний показатель которых составил 97 nm в данном изолированном образце желчи человека.

Электронная микроскопия также может быть использована для подтверждения размера изолированных частиц в желчи человека; на данном рисунке представлен типичный результат просвечивающей электронной микроскопии. В этих вестерн-блоттингах проводили поиск белков, обогащенных в экзосомах, таких как тетраспанин CD63 и Tsg101. На этом графике амплификации в реальном времени показаны различные виды микроРНК, экстрагированные из экзосом желчи человека.

Поскольку экзосомы не имеют надежных стандартов, таких как 18S или 28S рибосомальная РНК или гены «домашнего хозяйства», добавление синтетической микроРНК имеет важное значение для нормализации. Техника выделения экзосом может быть выполнена за три часа при правильном подходе. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как получать и обрабатывать желчь пациентов или животных для выделения и анализа внеклеточных везикул.

При воспроизведении данной процедуры важно помнить, что, если нет возможности провести ультрацентрифугирование, образец следует центрифугировать при 500 G и температуре 4 °C перед замораживанием при -80 °C. После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как исследование микроРНК, для получения ответов на дополнительные вопросы, например, об профилях микроРНК. Не забывайте, что работа с желчью может быть крайне опасной, так как она может содержать вирусы гепатита, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, включая использование перчаток и защитных очков.

После своей разработки данный метод открыл возможности для исследований в области холангиокарциномы по изучению внеклеточных везикул в качестве потенциальных биомаркеров в желчи пациентов с такими проблемами желчных путей, как обструкция PSA.