Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 2:32 мин. • April 30th, 2023
Экзосомы представляют собой наноразмерные сферические везикулы, окруженные липидным бислоем, содержащим молекулы ДНК, РНК и белка, присутствующие внутри просвета.
Чтобы визуализировать структуру экзосом с помощью просвечивающей электронной микроскопии, или ПЭМ, начните с взятия блока экзосомы — блока твердой матрицы, содержащего встроенные экзосомы. С помощью ультра-микротома получают ультратонкие срезы экзосомного блока.
Соберите секцию экзосомы на подходящую сетку и дайте ей прилипнуть к поверхности. Сетка обеспечивает стабильную поддержку образца экзосомы для последующих этапов окрашивания.
Затем поместите сетку над каплей уранилацетата - пятина тяжелого металла - и инкубируйте в течение желаемой продолжительности. Ионы уранила взаимодействуют с липидами, белками, ДНК и РНК, присутствующими в экзосомах.
Впоследствии окрашивают участок экзосомы цитратом свинца, который также связывается с экзосомальными биомолекулами. Цитрат свинца слабо связывается с предварительно связанными ионами уранила и усиливает контраст на фоне при визуализации.
Наблюдайте за дважды окрашенными экзосомами с помощью ПЭМ. ПЭМ фокусирует электронный пучок на образце экзосомы. Окрашенные участки в экзосоме рассеивают электроны сильнее по сравнению с неокрашенными областями.
Апертура объектива фильтрует эти сильно рассеянные электроны. Таким образом, экзосомы, содержащие окрашенные биомолекулы, кажутся темнее фона.
С помощью ультра-микротома подготовьте срезы толщиной 60 нанометров. Поместите срезы на никелевую сетку и дважды покрасьте некоторые из них 2% уранилацетатом на 20 минут, а затем цитратом свинца на 10 минут. Затем поместите окрашенный срез в просвечивающий электронный микроскоп и просмотрите образец с помощью напряжения 80 кВ и следуйте автоматическим настройкам времени экспозиции. Имея в виду изображение экзосомы, получите и сохраните изображение с помощью программного обеспечения микроскопа.