Исследование в Vivo метаболизма глюкозы в высоким содержанием жиров диеты кормили мышей с использованием тест на переносимость глюкозы в устной (ТТГ) и инсулина терпимости испытания (ITT)

Общая цель этих процедур состоит в том, чтобы охарактеризовать общий метаболический фенотип мышей и конкретно оценить изменения в метаболизме глюкозы in vivo. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области метаболизма. Они являются репрезентативными и мощными инструментами для исследования влияния генетических, фармакологических или диетических факторов на метаболизм глюкозы in vivo.

Основное преимущество этих методик заключается в том, что они относительно просты в исполнении. За день до перорального теста на толерантность к глюкозе переведите мышей в клетку со свежей подстилкой и питьевой водой, но без еды, чтобы они голодали в течение ночи перед тестированием. На следующий день приготовьте 10 миллилитров 20%-ного раствора глюкозы, разбавив 45%-ную D-глюкозу в дистиллированной воде.

Затем подготовьте планшет для сбора плазмы, добавив пять микролитров натрия ЭДТА на каждый момент времени для каждой мыши в лунки 96-луночного планшета. Во время эксперимента храните эту пластину на льду. Затем измерьте массу тела всех мышей и отметьте их хвосты постоянным маркером, чтобы мышей было легко различить.

Чтобы собрать кровь для исходного образца, с помощью острых ножниц аккуратно отрежьте один-два миллиметра кончика хвоста. Вытрите первую каплю крови, чтобы избежать гемолиза или загрязнения тканевой жидкостью, прежде чем брать новые образцы крови для определения уровня глюкозы в крови. Возьмите небольшой образец крови для измерения базального уровня глюкозы в крови с помощью глюкометра.

Затем соберите больший образец крови с помощью свежей капиллярной трубки. Опорожните капиллярную трубку с помощью пипетки, поместив наконечник пипетки в верхнюю часть конца капиллярной трубки и осторожно протолкнув собранную кровь в лунку 96-луночной пластины, избегая при этом пузырьков воздуха. Приготовьте 20%-ную D-глюкозу, растворенную в дистиллированной воде.

Чтобы ввести раствор глюкозы, сначала задержите мышь, крепко схватив ее за загривок. Нанесите достаточное жесткое покрытие на кожу вокруг шеи, чтобы мышь не выкручивалась наружу и не наклоняла голову назад. Убедитесь, что мышь может правильно дышать.

Затем осторожно направьте питательную иглу через рот в сторону пищевода. Дайте мышке проглотить иглу. После того как игла погрузится в нижний отдел пищевода мыши, введите раствор глюкозы.

Запустите таймер сразу после первого зондирования и вводите глюкозу всем остальным мышам с интервалом в одну минуту. После начала приема глюкозы очень важно правильно управлять временем. Через 15 минут измерьте уровень глюкозы в крови с помощью глюкометра, как и раньше.

А затем возьмите еще 30 микролитров образца крови от каждой мыши в том же порядке, в котором они были введены. Забор крови следует повторить через 30, 45, 60, 90, 120, 150 и 180 минут после введения глюкозы. Обеспечьте мышам доступ к питьевой воде в это время.

Когда измерения закончатся, верните мышей в домашние клетки, оборудованные едой и водой. Затем центрифугируйте образцы крови при температуре 2500 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость плазмы в пустые лунки 96-луночного планшета.

А затем хранить пластину при температуре минус 20 градусов по Цельсию до анализа. По крайней мере, через неделю после теста на толерантность к глюкозе голодайте на мышах в течение как минимум двух часов до инъекции инсулина, гарантируя, что мыши имеют доступ к питьевой воде. Разведите исходный раствор инсулина один к тысяче с 0,9% хлорида натрия и приготовьте растворенную в дистиллированной воде 20% D-глюкозу для введения в случае гипогликемии у мышей.

Взвесив мышей и разметив их хвосты, рассчитайте объем инсулина, необходимый для введения 0,75 единицы инсулина на килограмм массы тела. Затем отрежьте кончик хвоста острыми ножницами и измерьте базальный уровень глюкозы в крови, как и раньше. Чтобы ввести инсулин внутрибрюшинно, удерживайте мышь методом загривка, и наклоняйте голову мыши вниз под небольшим углом, чтобы обнажить брюшную сторону животного.

Поместите наполненный шприц под углом 30 градусов в нижний правый квадрант живота животного и введите объем со скосом стерильной иглы 30 калибра, повернутой вверх. Запустите таймер сразу после ввода первой мыши. Измеряйте уровень глюкозы в крови в выбранные моменты времени.

После финальных временных точек поместите мышей обратно в их домашние клетки, приготовленные с большим количеством еды и воды. Пероральный тест на толерантность к глюкозе был использован для сравнения метаболического фенотипа мышей, которых кормили на диете с высоким содержанием жиров в течение 12 недель, с мышами, которых кормили на диете с низким содержанием жиров. У мышей с толерантной к глюкозе LFD пиковый уровень глюкозы в крови примерно 240 мг на децилитр был достигнут примерно через 15 минут после введения глюкозы и сразу же после этого последовало снижение к исходному уровню, что указывает на надлежащее выведение глюкозы.

Напротив, у мышей с HFD был достигнут пик примерно в 320 мг на децилитровую глюкозу и почти полное отсутствие утилизации глюкозы. Поскольку уровни глюкозы в крови между двумя группами различаются в состоянии натощак, был проведен расчет площади под кривой выше исходного уровня глюкозы, и это подтвердило предыдущие результаты. Кроме того, уровень инсулина в крови определяли с помощью иммуноферментного анализа инсулина.

У мышей, которых кормили HFD, наблюдался повышенный уровень инсулина натощак по сравнению с контрольной группой, а также повышенный инсулиновый ответ, указывающий на индуцированную HFD компенсаторную гиперинсулинемию. Для измерения чувствительности к инсулину у мышей, получавших HFD, через неделю после перорального теста на толерантность к глюкозе был проведен тест на толерантность к инсулину. По сравнению с контрольной группой, получавшей ЛФД, у мышей, получавших ЛФД, наблюдалось нарушение снижения уровня глюкозы в крови после введения инсулина, что свидетельствует об инсулинорезистентности.

При попытке выполнить эту процедуру особенно важно поддерживать хорошее управление временем, а также снизить уровень стресса у мышей до минимума, чтобы получить надежные, воспроизводимые результаты. Различия в толерантности к глюкозе, уровнях инсулина и чувствительности к инсулину, которые получены в процентах методов, могут помочь смешать следующие сложные этапы. Это может включать, например, заявления о гипергликемии или гиперинсулинемии или эксперименты с изолированными островками поджелудочной железы.