Ответ слуховой ствола мозга и внешние клетки волос поклеточного патч зажим запись в послеродовой крыс

Этот протокол описывает методы для записи слуховой мозга ответ от послеродового крыса щенков. Для изучения функционального развития внешних волосковых клеток, экспериментальная процедура поклеточного фиксации записи в изолированные внешние клетки волос описан шаг за шагом.

Общей целью данного электрофизиологического анализа является изучение морфологических и функциональных изменений волосковых клеток улитки в период постнатального развития. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области слухового помощника, например, когда наши волосковые клетки приобретают свои функции во время начала слуха? Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем оценить функцию отдельных наружных волосковых клеток, выделенных от постнатальных детенышей крыс

Демонстрировать процедуру будут Вэньлу Пань, Шаша Го и Нана Сюй, которые были студентами нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, поместите животное под наркозом в форму из вспененного полиэтилена, чтобы обездвижить тело животного. Затем поместите животное на антивибрационный стол в комнате с шумоизоляцией.

Поддерживайте температуру тела животного на уровне 37,5 градусов Цельсия с помощью грелки. Далее протрите область головы 70%-ным этанолом. Сделайте разрез на один-два миллиметра вентрально-латерально к наружной ушной раковине, чтобы разместить электрод сравнения или заземляющий электрод.

Затем поместите субдермальный записывающий электрод на вершину черепа. С помощью генератора функций генерируйте откалиброванные тональные всплески различной частоты и интенсивности. Подавайте звуковые раздражители через электростатический динамик, расположенный на расстоянии 10 сантиметров от головы животного.

Для получения слуховых реакций ствола мозга вызванные звуком потенциалы фильтруются, усиливаются и усредняются с помощью многофункционального процессора. 40-минутная запись ABR отслеживается в режиме онлайн и сохраняется для анализа в автономном режиме. На этом участке простерилизуйте голову животного путем распыления 70% этанола.

Далее вскройте ножницами череп по сагиттальной средней линии и удалите мозг, чтобы обнажить внутреннее ухо. Затем перенесите внутреннее ухо в 35-миллиметровую чашку Петри, наполненную тремя миллилитрами ледяного L-15 Medium от Leibovitz. Под диссекционным микроскопом с помощью тонких щипцов удалите костную капсулу улитки.

После этого разверните OC и SV, связанные с модиолусом. Удерживая базальную часть SV щипцами, полностью отделите OC от SV, медленно раскручивая от основания к вершине. Впоследствии равномерно разрежьте OC на три части с помощью тонких ножниц.

Все этапы следует выполнять в ледяном L-15 как можно быстрее, чтобы свести к минимуму деградацию и повреждение тканей. На этом этапе с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров перенесите сегменты OC на предметное стекло. Зафиксируйте их 100 микролитрами 4%-ного параформальдегида в течение не менее четырех часов при четырех градусах Цельсия.

После этого промойте ткань, вытеснив параформальдегид 100 микролитрами свежего PBS. Затем промойте салфетку три раза по 10 минут каждый раз. После этого инкубируйте ткань с агентом проницаемости 0,3% в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.

Через 30 минут выбросьте средство проницаемости и трижды промойте салфетку PBS. Затем заблокируйте ткань 10% нормальной козьей сывороткой и PBS на один час при комнатной температуре. Инкубируйте ткань с концевым антителом к престину С и блокирующим раствором в течение двух часов при комнатной температуре или при четырех градусах Цельсия в течение ночи.

Затем промойте салфетку три раза PBS в течение пяти минут каждый раз. После этого инкубируйте ткань с конъюгированным с Alexa 488 вторичным антителом в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Промойте салфетку трижды с PBS в течение пяти минут каждый раз в темноте.

Далее инкубируйте ткань с родаминовым фаллоидином в течение 10 минут при комнатной температуре в темное время суток. Промойте салфетку трижды с PBS в течение пяти минут в темноте. Затем установите образец на предметное стекло с монтажным материалом.

Визуализируйте его с помощью конфокальной микроскопии с использованием лазеров 405 нанометров, 488 нанометров и 594 нанометров. В этой процедуре используйте съемник пипетки и микрофальцевку. Изготавливают патч-пипетки с диаметром наконечника в два-три микрона.

Затем заполните пипетки внутриклеточным раствором. С помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров переложите кусочек OC в 35-миллиметровую чашку Петри. Переварите ткань со 100 микролитрами ферментативной среды для пищеварения в течение пяти минут при комнатной температуре.

Далее вытесните ферментативную среду для пищеварения на 100 микролитров L-15. Разрежьте ткань на небольшие кусочки с помощью микроскальпеля, чтобы изолировать клетки волоса. После аккуратного пипетирования перенесите клетки в самодельную небольшую пластиковую камеру, наполненную раствором для ванны, не содержащей ферментов.

Затем поместите камеру на предметное столико инвертированного микроскопа и найдите здоровые одиночные OHC. Затем загрузите патч-пипетку в головной каскад усилителя 700B. Расположите патч-пипетку вокруг нижней части наружной волосяной ячейки.

После этого весь клеточный пластырь зажимает OHC, герметизируя боковую стенку тела клетки. Применяйте легкое отсасывание до тех пор, пока клеточная мембрана не разорвется. Затем установите удерживающий потенциал на 70 милливольт.

Ячейки с сопротивлением доступа в диапазоне от 10 до 17 мегаОм и сопротивлением мембраны в диапазоне от 100 до 500 мегаОм считаются удачной конфигурацией целых ячеек. Подайте гиперполяризующее и деполяризующее напряжение на ячейку, чтобы вызвать токи всей ячейки. Измерьте емкость мембраны OHC с помощью протокола двухсинусоидального напряжения стимула, управляемого программным обеспечением патч-зажима.

Установите диапазон напряжения стимуляции от 140 до 110 милливольт и сохраните данные для анализа в автономном режиме. После щадящего разложения OHC были выделены из OC. Запись напряжения клещей всей ячейки проводилась от OHC, остро изолированных от улитки крысы. Здесь показан репрезентативный пример полного тока клетки, зарегистрированного от изолированного P9 OHC в ответ на изменение мембранного потенциала со 140 до 107 милливольт.

На этом рисунке показана нелинейная мембранная емкость, полученная от двух OHC разного возраста. Емкостные характеристики напряжения были подогнаны к функции Больцмана. После освоения эту технику можно сделать за два часа, если она выполнена правильно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие меры, такие как вестерн-блоттинг и ПЦР, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как оценка уровня экспрессии некоторого белка, такого как престин, в наших волосковых клетках. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области волосковых клеток к изучению электрофизиологических свойств в улитке и вестибулярной системе. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как исследовать морфологические, а также функциональные изменения волосковых клеток улитки во время постнатального развития.