Характеризующие клеток миграции в рамках трехмерной в Vitro рану среды

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за влиянием специфических методов лечения, представляющих интерес, на миграцию клеток в трехмерном фибриновом каркасе, ассоциированном с раной. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области заживления ран, о том, как изменения в структуре волоконной сети влияют на миграцию клеток и на фибриновые сгустки в местах раны, основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает простой и воспроизводимый метод анализа миграции клеток в фибриновых сгустках в 3D. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что перенос сфероидов может быть затруднен.

Начните с нагревания флакона с замороженным неонатальным дермальным фибробластом человека на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Когда клетки только размораживаются, соберите их центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в свежей среде дермальных фибробластов человека в концентрации 1 х 10 до 6-х клеток на миллилитр. Затем посейте клетки в колбу для культуры T75 для 72-часовой инкубации при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Когда культура достигнет 80% конфлюенции, отделите клетки пятью миллилитрами трипсина ЭДТА. Через пять минут при температуре 37 градусов Цельсия нейтрализуйте трипсин пятью миллилитрами подогретой среды и смешайте 40 микролитров клеток с трипановым синим в соотношении 1:1. Оставьте 10 микролитров аликвоты клеток для подсчета.

Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в концентрации 1,25 х 10 до 5-й клетки на миллилитр. Далее застелите дно 10-сантиметровой чашки Петри пятью миллилитрами стерильного PBS. Затем переверните крышку чашки Петри и добавьте многократные капли по 20 микролитров клеточной суспензии на внутреннюю поверхность крышки.

Когда все капли будут помещены, снова заверните крышку на чашку, стараясь не сместить свисающие капли, и осторожно поместите чашку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 72 часа. В конце инкубации добавьте 100 микролитров раствора сгустка на сфероид на лунку, в 48-луночную пластину и осторожно встряхните и постучите по пластине, чтобы убедиться, что смесь фибрина покрывает всю лунку. Поместите тарелку в инкубатор на один час.

Когда слой сгустка полимеризуется, подтвердите наличие сфероидов в культуре висячих капель, под световым микроскопом и перенесите 48-луночный планшет и чашку для культуры висячих капель в колпак для клеточных культур. Осторожно переверните крышку чашки Петри, чтобы получить доступ к висящим культурам капель, и используйте одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 21 калибра, чтобы закачать по одной капле в каждую лунку, покрытую фибрином. Я проявляю особую осторожность при аспирации и покрытии сфероидов, так как самым сложным и ответственным этапом в этом процессе является перенос сфероидов без их разрушения.

Рассмотрите планшет под микроскопом, чтобы убедиться, что сфероиды были правильно засеяны в соответствующие лунки. Аккуратно нанесите 100 микролитров свежеприготовленного раствора сгустка на каждую каплю, содержащую сфероиды, и повторно исследуйте сфероиды под микроскопом, чтобы убедиться, что они все еще целы и находятся в центре каждой лунки. Затем верните 48-луночную пластину в инкубатор, чтобы дать возможность второму слою фибрина полимеризоваться.

Через час обработайте каждую лунку 500 микролитрами соответствующей среды для соответствующей экспериментальной группы сфероидов и верните планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Получайте изображения сфероидов с помощью светлопольной микроскопии каждые 24–72 часа, используя стек z для просмотра последовательных поперечных сечений 3D-культуры клеток. Затем в соответствующем программном обеспечении для анализа изображений отследите границу каждой ячейки каждого сфероида в каждой последующей точке времени и используйте функцию измерения для доступа к процентному увеличению площади для каждого сфероида.

После их культивирования, в про- или антимиграционном агенте, представляющем интерес, исходные участки сфероидов могут быть определены с помощью микроскопической визуализации в светлом поле и использованы в качестве эталона для определения степени последующего роста клеток из сфероидных тел в каждый последующий момент времени. В этом репрезентативном эксперименте сфероиды, подвергшиеся воздействию промиграционного агента, продемонстрировали значительно повышенную степень миграции от исходного сфероидного тела по сравнению со сфероидами, подвергшимися воздействию ингибитора миграции или контролирующего агента. И наоборот, сфероиды, подвергшиеся воздействию антимиграционного агента, продемонстрировали значительно меньшую степень миграции от исходного сфероидного тела по сравнению со сфероидами в контроле.

После освоения эта техника может быть выполнена за два с половиной часа, не считая времени культивирования клеток, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как культивировать и встраивать сфероиды клеток для трехмерных анализов миграции клеток in vitro. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как гистологическая и иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как структура фибриновой сети внутри сгустка или выравнивание актина в сфероидных клетках соответствуют увеличению или уменьшению миграции клеток.

Не забывайте, что работа с клеточными культурами и иглами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение надлежащих защитных средств и работа в стерильном капюшоне.