С использованием трехцветной сингл молекула лад для изучения корреляции взаимодействий протеина

Общая цель этой процедуры заключается в количественном изучении динамики сложных белковых систем с акцентом на коррелированные взаимодействия, такие как кооперативность. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области количественной биологии, где белковые комплексы и их динамические взаимодействия имеют центральное значение. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет применять динамические многоцветные одномолекулярные FRET к биологически значимым системам.

Перед сборкой проточной камеры вырежьте проточный канал в прозрачной клейкой пленке толщиной 40 микрон, распылите быстрофиксирующий клей на неадгезивную сторону пленки и дайте клею высохнуть. Для начала сборки проточной камеры получите функционализированное стекло из биотина PEG толщиной три миллиметра с входным и выпускным отверстиями. Нанесите сторону потолочной пленки, покрытую аэрозольным клеем, на функционализированную сторону слайда, совместив канал с впускным и выпускным крючками.

Нагрейте предметное стекло до 80 градусов Цельсия на горячей плите в течение одной минуты. Прижмите пленку к предметному стеклу в течение 30 секунд с помощью дополнительного предметного стекла микроскопа, чтобы равномерно распределить давление. А затем дайте сборке остыть в течение одной минуты.

Снимите защитную пленку, покрывающую клей. Наденьте защитный лист на экспонированный клей, чтобы образовалась проточная камера. Нагрейте камеру до 80 градусов Цельсия в течение одной минуты.

Прижмите защитный листок к клею на 30 секунд, чтобы герметизировать камеру и дать собранной камере остыть. Нанесите каплю глицерина на поверхность призмы, прежде чем поместить проточную камеру на призму. Установите проточную камеру в держатель для многоцветного призматического микроскопа типа TIRF.

По завершении подсоедините впускную и выпускную трубки. Чтобы начать настройку прибора для измерения трех цветов, откройте программное обеспечение ПЗС-камеры, умножающее электроны, установите датчик EMCCD на минимально возможную температуру. Установите скорость сдвига камеры по вертикали на 3,3 микросекунды, выберите нормальное вертикальное тактовое напряжение, установите скорость горизонтального считывания на 17 миллигерц при 16 битах, усиление предварительного усиления на три и уровень умножителя электронов на 1000.

Выберите запуск внешнего захвата. Установите время экспозиции на 70 миллисекунд. А продолжительность записи видеоролика до 750 циклов захвата.

Создайте новую папку для файлов измерений. Включите автосохранение в программном обеспечении EMCCD и установите формат файла кадра фильма TIFF. Задайте путь к файлу автосохранения для вновь созданной папки.

Затем откройте программное обеспечение, управляющее акустооптическим перестраиваемым фильтром, программное обеспечение управления лазером и программное обеспечение триггера, синхронизирующее лазеры, AOTF, оптические затворы и камеры. Используйте AOTF для регулировки мощности лазера примерно до трех милливатт перед входом в призму. Загрузите схему запуска, которая синхронизирует все устройства для переменного лазерного возбуждения, затем установите держатель образца в прибор.

Поместите конец входной трубки в микроцентрифужную пробирку, содержащую буфер для эксперимента. Подсоедините выходную трубку к набору шприцевых насосов для режима забора. Промойте камеру 150 микролитрами буфера.

Сфокусируйте ПЗС-камеру на функционализированном интерфейсе, выровняйте пучки возбуждения и отбеливайте флуоресцентные загрязнители. Затем влейте 300 микролитров 0,25 миллиграмма на миллилитр раствора дегликозилированного авидина и буферизируйте в камеру и инкубируйте в течение одной минуты. Смойте несвязанный дегликозилированный авидин из камеры с буфером.

Затем через камеру пропускают 300 микролитров буфера с концентрацией BSA 0,5 мг на миллилитр для блокировки дефектов функционализации поверхности. Затем загрузите в проточную камеру 150 микролитров порций биотинилированного флуоресцентно меченного Hsp90 биотинилированного флуоресцентного меченного Hsp90 буфера при возрастающей концентрации Hsp90 до тех пор, пока не будет достигнута достаточная поверхностная плотность. Смойте несвязанный белок из камеры 300 микролитрами буфера, содержащего BSA.

Загрузите в камеру 150 микролитров 25 наномолярного раствора меченого AMP-PMP и BSA-содержащего буфера и инкубируйте в течение пяти минут. Повторите загрузку и инкубацию один раз. Затем с помощью пьезошагового элемента переместите камеру образца перпендикулярно лучу возбуждения, чтобы изменить поле зрения по желанию.

При необходимости отрегулируйте фокус изображения. Запустите запись с камеры в программном обеспечении камеры, нажав кнопку «Захватить сигнал», как показано на рисунке. Инициируйте циклы регистрации возбуждения в программном обеспечении-триггере, чтобы начать сбор данных.

Чтобы начать анализ данных, откройте программное обеспечение для анализа и импортируйте записанные видеоролики с двух камер. Нажмите кнопку «Найти трассы», чтобы определить следы интенсивности флуоресценции, соответствующие потенциальным одиночным молекулам. Для каждой молекулы вычислите сумму всех следов этого пятна с одинаковым цветом возбуждения.

Оцените профили интенсивности во всех каналах для примерно ровного плато в интенсивности соединения и одного этапа обесцвечивания для всех цветов возбуждения. Ищите антикоррелированное поведение в соответствующих каналах обнаружения и появление красной флуоресценции в трассе. Если все критерии соблюдены, сохраните следы флуоресценции для дальнейшего анализа.

Только указанная молекула удовлетворяет критериям в данном примере. Исключите трассы, которые не имеют плоских плато, которые показывают мигающие события, а не антикорреляцию, или которые имеют несколько ступеней обесцвечивания. Выбор следов является критически важным этапом во всех методах работы с одиночными молекулами.

Следует выбирать только те трассы, которые удовлетворяют четко определенным критериям. Здесь этими критериями являются антикорреляция, одиночные ступени обесцвечивания и плоские плато. Далее выводим сохраненные молекулы одну за другой и одним набором следов интенсивности, выбираем временной интервал, в котором все четверки этажей уже обесцвечены.

Рассчитайте интенсивность фона луча для этого временного интервала, затем выберите диапазон эффективности FRET, в котором присутствуют оба красителя на Hsp90, обязательно исключив следы с мигающими событиями. Рассчитайте частичные кривые флуоресценции. Исключите молекулы с низким соотношением сигнал/шум в следах.

Затем сгенерируйте 2D-проекции привязки данных частичной флуоресценции и запустите инструмент расчета относительной численности населения. Нажмите кнопку Инициализация. Нарисуйте многоугольник вокруг пика интереса.

И нажмите Count, чтобы вычислить относительную численность населения для этого пика. Создание 3D-гистограммы данных частичной флуоресценции и нормализация гистограммы. Превысьте начальные параметры для 3D-гауссова аппроксимации и добавьте популяции состояний в конец вектора параметров.

Подгонка данных и отображение результатов. После определения положения и ширины каждого состояния в 3D частичном флуоресцентном пространстве инициализируйте интерфейс Hidden Markov Model. Выберите соответствующее количество состояний, количество размерностей входного сигнала и тип входного сигнала.

Оптимизируйте параметры HMM, чтобы определить оценки максимального правдоподобия для вероятностей перехода. Повторите выбор, аппроксимацию и оптимизацию HMM для подмножеств данных. Наконец, вычислите доверительный интервал для вероятностей перехода и сверните конформационные состояния, чтобы упростить данные для дальнейшего анализа.

Конформационные состояния белка Hsp90 изучали с помощью трехцветной одномолекулярной молекулы FRET в присутствии меченого репортерного нуклеотида AMP-PMP. Пять конформационных состояний были различимы по интенсивности флуоресценции, причем четыре из этих состояний были функционально различными. Трехцветный одномолекулярный FRET привел к получению данных частичной флуоресценции, охватывающих 3D-пространство.

Для разделения состояний были использованы 2D-проекции, поскольку все состояния, теоретически ожидаемые в условиях эксперимента, различимы по их частичному расцвету в 2D-проекциях. Относительная численность населения этих штатов была определена на основе 2D-проекций и использовалась в качестве ограничений для 3D-гауссовых аппроксимации. Последующая оптимизация и моделирование ансамбля 3D HMM позволили получить извлеченные вероятности перехода состояния.

Доверительные интервалы рассчитывались для каждой извлеченной константы скорости. Повторение экспериментов в присутствии дополнительных 250 микромоляров немеченого AMP-PMP позволило выяснить влияние связывания одного нуклеотида на второй сайт связывания в димере Hsp90. Схлопывание связанных и несвязанных конформаций позволило рассчитать среднее время задержки флуоресцентной диссоциации АМФ-ПМП от Hsp90 в присутствии и отсутствии дополнительных немеченых АМФ-ПМП.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как извлекать кинетическую информацию из динамической белковой системы с помощью многоцветного FRET и микроскопа TIRF. Этот метод открывает исследователям в области наук о жизни путь к определению коррелированных взаимодействий в мультибелковых системах. Это важно для более глубокого понимания фундаментальных механизмов регулирования, таких как кооперативность.