Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Для обнаружения белок-белкового взаимодействия на основе флуоресцентной анизотропии начните с рекомбинантных белков-мишеней, помеченных С-концевыми мотивами тетрацистеина в подходящем буфере анизотропии.
Добавьте флуорофорсодержащий краситель — связывание с белками-мишенями через мотив тетрацистеина. Диализуйте с помощью анизотропного буфера, удаляя несвязанный краситель. Переложите смесь в кварцевые кюветы. Измерьте абсорбцию, определив процент успешно меченых целевых белков.
В флуоресцентной кювете смешайте меченные флуорофором целевые белки с немечеными белками. С помощью спектрофлуориметра измерьте анизотропию флуоресценции.
Поскольку целевые белки свободно подвешивают в буфере, прикрепленные к ним флуорофоры случайным образом вращаются вокруг своих осей из-за броуновского движения. При возбуждении вертикально поляризованным светом соответствующей длины волны флуорофоры излучают свет, поляризованный в вертикальной и горизонтальной плоскостях. Измерено соотношение интенсивностей флуоресценции вертикального и горизонтально поляризованного излучения — анизотропия.
Когда немеченые белки связываются с мечеными флуорофорами мишенями, молекулярный размер белкового комплекса увеличивается, уменьшая его вращательное движение. В результате излучаемый свет становится более поляризованным, с более высоким излучением в вертикальной плоскости, чем в горизонтальной, что приводит к увеличению анизотропии.
Добавьте увеличивающиеся концентрации немеченого белка и повторите измерение анизотропии.
Нелинейное увеличение анизотропии с увеличением добавления немеченого белка указывает на связывание немеченого белка в нескольких неидентичных сайтах связывания на флуорофорных меченных белках-мишенях.
Смешайте 3 наномоли белка SBDS-FlAsH с 3 наномолями красителя Lumio Green в 5-микролитровом буфере анизотропии. Дайте реакции протекать в течение 8 часов при температуре 4 градуса Цельсия. Через 8 часов диализуйте образец в буфере анизотропии на ночь, чтобы удалить свободный краситель. Измерьте поглощение на 280 нанометрах и 508 нанометрах в спектрофотометре с помощью кварцевой кюветы. Затем используйте закон Ламберта-Бера для количественной оценки процента меченого белка, как описано в текстовом протоколе.
Перед измерением значения анизотропии следует тщательно проводить каждый этап титрования белок-лиганда, следя за тем, чтобы весь образец был дозирован в раствор и стал однородным.
Во флуоресцентную кювету поместите 200 микролитров 30 наномолярных SBDS-FlAsH в анизотропный буфер и титруйте 2 микролитра 30 микромолярных EFL1. Тщательно перемешайте и дайте реакции постоять 3 минуты, прежде чем измерять анизотропию и значение флуоресценции. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет добавлен общий объем EFL1 в 40 микролитров. В качестве последнего шага подгоните данные под предполагаемую модель привязки, как описано в текстовом протоколе.
