Почему анизотропия увеличивается при связывании белка?

Анизотропия возрастает, когда немеченые белки связываются с мишенями, меченными флуорофором, что увеличивает молекулярный размер комплекса и замедляет вращательное движение. Это приводит к увеличению доли вертикально поляризованного излучаемого света по сравнению с горизонтально поляризованным. Данное изменение фиксируется как более высокое значение анизотропии, что свидетельствует об успешном взаимодействии.

Как определяется процент меченого белка?

Процент меченого белка количественно определяют путем измерения абсорбции при 280 нм и 508 нм с помощью спектрофотометра и кварцевой кюветы с последующим применением закона Ламберта-Бера. Этот этап обеспечивает точную нормализацию данных анизотропии относительно доли успешно меченых целевых белков. Данная процедура проводится после диализа для удаления несвязавшегося красителя, чтобы исключить влияние свободного флуорофора.

О чем свидетельствует нелинейное увеличение анизотропии?

Нелинейное увеличение анизотропии при повышении концентрации немеченого белка указывает на связывание в нескольких неодинаковых центрах на мишени, меченной флуорофором. Такая закономерность отражает гетерогенность аффинности связывания или кооперативные взаимодействия, а не модель с одним центром связывания. Подобные данные служат основанием для более глубокого механистического анализа сложности взаимодействия.

Почему важно проводить повторности в титрованиях на анизотропию?

Повторение опыта гарантирует однородность каждого этапа титрования и равномерное перемешивание всего образца перед измерением. Неравномерное перемешивание может привести к вариабельности показаний анизотропии, что затрудняет интерпретацию кривой связывания. Тщательное выполнение повторов способствует надежной аппроксимации данных моделям связывания и обеспечивает сопоставимость результатов между различными экспериментами.

Какой аналитический этап следует за сбором данных об анизотропии?

После сбора значений анизотропии в серии титрования данные аппроксимируются согласно предполагаемой модели связывания, как описано в протоколе. Этот этап позволяет количественно определить аффинность связывания, стехиометрию и возможную кооперативность. Подбор модели преобразует необработанные измерения анизотропии в значимые данные для валидации мишени и оптимизации соединений-лидеров.

Обнаружение белок-белковых взаимодействий на основе флуоресцентной анизотропии

JoVE Encyclopedia of Experiments

Биологические методы

0 просмотров • 3:41 мин • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для обнаружения белок-белкового взаимодействия на основе флуоресцентной анизотропии начните с рекомбинантных белков-мишеней, помеченных С-концевыми мотивами тетрацистеина в подходящем буфере анизотропии.

Добавьте флуорофорсодержащий краситель — связывание с белками-мишенями через мотив тетрацистеина. Диализуйте с помощью анизотропного буфера, удаляя несвязанный краситель. Переложите смесь в кварцевые кюветы. Измерьте абсорбцию, определив процент успешно меченых целевых белков.

В флуоресцентной кювете смешайте меченные флуорофором целевые белки с немечеными белками. С помощью спектрофлуориметра измерьте анизотропию флуоресценции.

Поскольку целевые белки свободно подвешивают в буфере, прикрепленные к ним флуорофоры случайным образом вращаются вокруг своих осей из-за броуновского движения. При возбуждении вертикально поляризованным светом соответствующей длины волны флуорофоры излучают свет, поляризованный в вертикальной и горизонтальной плоскостях. Измерено соотношение интенсивностей флуоресценции вертикального и горизонтально поляризованного излучения — анизотропия.

Когда немеченые белки связываются с мечеными флуорофорами мишенями, молекулярный размер белкового комплекса увеличивается, уменьшая его вращательное движение. В результате излучаемый свет становится более поляризованным, с более высоким излучением в вертикальной плоскости, чем в горизонтальной, что приводит к увеличению анизотропии.

Добавьте увеличивающиеся концентрации немеченого белка и повторите измерение анизотропии.

Нелинейное увеличение анизотропии с увеличением добавления немеченого белка указывает на связывание немеченого белка в нескольких неидентичных сайтах связывания на флуорофорных меченных белках-мишенях.

Смешайте 3 наномоли белка SBDS-FlAsH с 3 наномолями красителя Lumio Green в 5-микролитровом буфере анизотропии. Дайте реакции протекать в течение 8 часов при температуре 4 градуса Цельсия. Через 8 часов диализуйте образец в буфере анизотропии на ночь, чтобы удалить свободный краситель. Измерьте поглощение на 280 нанометрах и 508 нанометрах в спектрофотометре с помощью кварцевой кюветы. Затем используйте закон Ламберта-Бера для количественной оценки процента меченого белка, как описано в текстовом протоколе.

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 15 августа 2026

Обнаружение белок-белковых взаимодействий на основе флуоресцентной анизотропии

Обзор

Основные компоненты исследования

Область науки

Теоретические основы

Цель исследования

Используемые методы

Основные результаты

Заключение

Часто задаваемые вопросы

Значимость для промышленности

Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках

Первичный поиск и валидация мишени

Скрининг и разработка анализа

Трансляционные и доклинические исследования

Интеграция конвейера и рабочего процесса

Операционное и корпоративное воздействие

Рекомендации по внедрению

Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике

Структурная информация от одной молекулы FRET Эксперименты с помощью быстрого нано-системы позиционирования

Open Source High Content Analysis Используя Автоматизированное время жизни флюоресценции визуализации микроскопии

Изображениями белок-белковых взаимодействий В естественных условиях

Флуоресцентная флуктуационная спектроскопия для изучения гомоолигомеризации белков

Анизотропия флуоресценции для определения аффинности связывания фактора транскрипции и ДНК

Определение белков-лиганд с использованием дифференциальной сканирующей флуориметрии

Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

С использованием трехцветной сингл молекула лад для изучения корреляции взаимодействий протеина

Обнаружение Heterodimerization изоформ белка, используя Assay в Situ близости лигирование