Обнаружение белок-белковых взаимодействий на основе флуоресцентной анизотропии

Для обнаружения белок-белкового взаимодействия на основе флуоресцентной анизотропии начните с рекомбинантных белков-мишеней, помеченных С-концевыми мотивами тетрацистеина в подходящем буфере анизотропии.

Добавьте флуорофорсодержащий краситель — связывание с белками-мишенями через мотив тетрацистеина. Диализуйте с помощью анизотропного буфера, удаляя несвязанный краситель. Переложите смесь в кварцевые кюветы. Измерьте абсорбцию, определив процент успешно меченых целевых белков.

В флуоресцентной кювете смешайте меченные флуорофором целевые белки с немечеными белками. С помощью спектрофлуориметра измерьте анизотропию флуоресценции.

Поскольку целевые белки свободно подвешивают в буфере, прикрепленные к ним флуорофоры случайным образом вращаются вокруг своих осей из-за броуновского движения. При возбуждении вертикально поляризованным светом соответствующей длины волны флуорофоры излучают свет, поляризованный в вертикальной и горизонтальной плоскостях. Измерено соотношение интенсивностей флуоресценции вертикального и горизонтально поляризованного излучения — анизотропия.

Когда немеченые белки связываются с мечеными флуорофорами мишенями, молекулярный размер белкового комплекса увеличивае