Эффективная изоляция стволовых клеток, полученных из адипоза, и адипоцитов из жировой ткани свинины

Цель этого исследования — эффективно и быстро изолировать клетки из жировой ткани. Традиционное пищеварение требует затрат времени и может перевариваться. Наши ферментные и механические волновые меры обеспечивают мягкую дисперсию и сокращают время изоляции.

Для начала положите кусок подкожной жировой ткани эвтаназии свиньи в культурную чашу. Рассекать по естественной плоскости между жировой тканью и дермой, чтобы получить полный слой ULB толщиной от двух до трёх миллиметров. Прополосните ULB один раз ледяным стерильным физиологическим раствором.

После разрыва стерильной чаши для культуры взвесьте ткани в стерильной чаше на предварительно стерилизованных весах. На каждые 1,8 грамма ткани добавьте 10 миллилитров ледяного буфера D-Hank и держите ткань полностью погруженной. Используйте стерильные хирургические ножницы, чтобы выявить и удалить все видимые кровеносные сосуды из ткани.

Удалять соединительные ткани и фиброзные компоненты. Выбросить вырезанные материалы в специальные контейнеры для биологической опасности. Промывайте ткани внутри буфера D-Hank, чтобы удалить остатки крови и остатка.

Взвесьте ткань в стерильной культурной чаше на предварительно стерилизованных весах после разрыва блюда. Перенесите 1,8 грамма фрагментов промывки в стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 миллилитра. Добавьте 800 микролитров буфера для диссоциации тканей типа A в пробирку.

Используйте стерильные офтальмологические ножницы, чтобы измельчить ткань в трубке на кусочки размером примерно от одного до двух кубических миллиметров. Перенесите измельчённую ткань вместе с окружающим буфером в новую микроцентрифугную трубку. Добавьте 200 микролитров агента для диссоциации тканей типа А в пробирку.

Аккуратно поверните и встряхните трубку вручную три раза, чтобы смешать содержимое. Убедитесь, что жировые фрагменты полностью погружены в раствор диссоциации. Проверьте, плотно ли закрыта крышка трубки.

Поместите трубку в металлическую ванну при температуре 37 градусов Цельсия и инкубуйте от пяти до десяти минут. Переместить частично переваренную жировую ткань в буфере в стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 миллилитра, предназначенную для системы механической диссоциации. Запустите заранее заданную программу для проведения механической диссоциации жировой ткани с помощью синусоидальной волны 200 герц.

Соберите подвеску элемента и пропустите её через 200-микрометровый фильтр в новую 50-миллилитровую центрифугную трубку. Добавьте пять миллилитров предварительно охлаждённого раствора D-Hank при 4 градусах Цельсия в сито. Прополосните сито дважды раствором D-Hank.

Центрифугуйте фильтрованную ячейку при 500 G в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия. Используйте стерильную пипетку Пастера для аспирации и удаления поверхностного липидного слоя, оставляя один миллилитр буфера для защиты слоя адипоцитов. Соберите второй слой, содержащий адипоциты, не нарушая третий и четвёртый слои.

Аспирируйте и сбросьте третий слой. Добавьте один миллилитр буфера Д.Хэнка к нижней грануле с стромальной сосудистой фракцией (SVF). Аккуратно суспензируйте клеточную гранулу в буфере, чтобы получить концентрацию от двух до пяти размноженных на 10 при мощности шесть элементов на миллилитр.

Подготовьте подвеску SVF-ячейки в микроцентрифугной трубке объемом 1,5 миллилитра. Держите подвеску на льду до использования. Добавьте 10 микролитров суспензии SVF-ячейки и 10 микролитров раствора 0,4% трипана синего в стерильную трубку для микроцентрифуг объемом 0,5 миллилитра.

Аккуратно трижды поднимайтесь и опускайте пипетку. Перенесите 10 микролитров окрашенной клеточной смеси на счётное стекло, подходящее для автоматического счётчика ячеек. Убедитесь, что образец полностью заполняет камеру без переполнения.

Вставьте счётный слайд в автоматический счётчик ячеек. Выберите тип анализа трипан-синий и при необходимости отрегулировать диапазон концентрации ячеек. Нажмите подсчёт, чтобы запустить автоматический подсчёт ячеек.

Следите за изображениями в камере подсчёта и наблюдайте за автоматическим различием между живыми и мёртвыми клетками. Запишите процент жизнеспособности ячеек и общее количество жизнеспособных ячеек на экране прибора. Проведите три независимых измерения для каждого образца.

Вычислите среднюю жизнеспособность и выход клетки на грамм жировой ткани. Приготовьте раствор для окрашивания с пятью микрограммами на миллилитр и одним микромолярным BODIPY в D.Hank's. Инкубировать изолированные адипоциты в растворе для окрашивания в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия.

Используйте самодельную систему стеклянного стекла, дружественную к адипоцитам, для подготовки стеклян, подходящих для флуоресцентной микроскопии. Самодельная система крепления, дружественная к адипоцитам, обеспечивала равномерное распределение целых адипоцитов для чёткой визуализации. В отличие от традиционных методов, приводящих к многослойным и многослойным структурам, извлечённые адипоциты имели целостную структуру и нормальную морфологию.

Выживаемость адипоцитов методом механической диссоциации была значительно выше по сравнению с традиционным методом ферментативного гидролиза. Очищенные и культивированные стволовые клетки, полученные из жира, имели однородную фибробластную морфологию с удлинёнными веретенообразными клетками, расположенными в упорядоченном порядке. Большинство клеток оставались неокрашенными, что указывает на жизнеспособность, тогда как лишь небольшая часть была окрашена в синий цвет, представляя собой мёртвые клетки.

Этот протокол позволяет исследователям сравнивать изолированные клеточные характеристики по всему жировому депо. Изолированные SVF из протокола могут использоваться для построения органоидов и очистки жировых стволовых клеток. Будущие исследования могут дополнительно оптимизировать метод изоляции, учитывая вариации жировой ткани в внеклеточном матриксе по всему депо.