Характеристика иммунных клеток в жировых тканях человека с помощью проточной цитометрии

Общая цель этой процедуры заключается в использовании проточной цитометрии для выделения стромальной васкулярной фракции из жировой ткани человека для фенотипирования различных иммунных клеточных популяций, обнаруженных в жировой ткани. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы метаболических исследований, например, какие иммунные клетки накапливаются в жировой ткани людей с ожирением и в какой степени. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет одновременно измерять несколько маркеров на иммунных клетках, а также идентифицировать и количественно оценивать эти иммунные клетки в жировой ткани.

Хотя этот метод может дать решающее представление о воспалении жировой ткани, он также может быть применен к другим органам и тканям. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, в основном борются с загрязнением стромальных сосудистых клеток и потерей клеток во время процедуры окрашивания. Двое из моих кандидатов на докторскую степень, Сьюзан Ветцельс и Митчелл Бейнен, будут выполнять протокол.

Начните с использования скальпеля, чтобы измельчить один грамм биопсии жировой ткани примерно на квадратные кусочки размером примерно два миллиметра. Переложите кусочки в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и добавьте к образцам 10 миллилитров раствора коллагеназы. Инкубируйте фрагменты ткани в течение 60 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия со скоростью 60 циклов в минуту.

Затем следует фильтрация через сетчатый фильтр 200 микрон в новую коническую трубку объемом 50 миллилитров. Перед центрифугированием промойте фильтр семью миллилитрами PBS. Затем с помощью пипетки удалите надосадочную жидкость, не погружая весь наконечник пипетки в раствор.

Гранула должна быть хорошо видна и удалять практически всю надосадочную жидкость, чтобы избежать загрязнения стромальной васкулярной фракции жировыми клетками. Мы суспензируем гранулу стромальных сосудистых клеток пятью миллилитрами свежей PBS и фильтруем стромальную васкулярную фракцию через ситечко 70 микрометров в новую пробирку. После центрифугирования мы суспензируем промытую гранулу стромальной васкулярной фракции в трех миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов на пять минут на льду.

Затем остановите лизис семью миллилитрами PBS и гранулируйте клетки центрифугированием. Чтобы окрашивать стромальную сосудистую фракцию для проточного цитометрического анализа, ресуспендируйте гранулу в 90 микролитрах четырехградусной флуоресцентной активированной сортировки клеток или буфера FACS и заблокируйте неспецифическое окрашивание десятью микролитрами человеческого IgG. Разделите суспензию клеток между двумя лунками 96-луночной пластины с V-образным дном и поместите клетки на лед на 15 минут.

В конце инкубации промойте каждый образец 100 микролитрами буфера FACS, переворачивая планшет одним плавным движением, не постукивая, чтобы отбросить надосадочную жидкость в конце центрифугирования. Убедитесь, что вы хорошо видите гранулу в нижней части пластины, прежде чем переворачивать ее вверх ногами, чтобы предотвратить потерю клеток во время процедуры. Ресуспендируйте первую гранулу в 29,5 микролитрах коктейля антител для первой панели FACS и вторую гранулу в 23 микролитрах коктейля антител для второй панели FACS.

После 30 минут на льду в темноте промойте клетки 150 микролитрами буфера FACS на лунку и зафиксируйте клеточные гранулы в 150 микролитрах однопроцентного раствора формальдегида. Перенесите клеточные суспензии из каждой лунки в соответствующие пробирки FACS и поместите образцы на лед. Перед их анализом загрузите неокрашенный отрицательный регулятор на проточный цитометр, чтобы установить параметры прямого и бокового рассеяния.

Затем отрегулируйте напряжение проточного цитометра в соответствии с инструкциями производителя до тех пор, пока все интересующие популяции не станут видны на графиках прямого и бокового рассеяния, и можно будет провести различие между мусором и живыми клетками. Когда все параметры заданы, сделайте вихрь первым экспериментальным образцом при 800 оборотах в минуту, чтобы полностью ресуспендировать клетки и загрузить образец на цитометр. Считайте минимум 50 000 событий в реальном затворе, затем сделайте вихрь и загрузите второй образец для анализа, как показано только что продемонстрировано.

Чтобы провести анализ популяций макрофагов жировой ткани в этом репрезентативном эксперименте, другие иммунные клетки, такие как Т-клетки, В-клетки, нейтрофилы и естественные клетки-киллеры, были исключены, чтобы выявить присутствие CD11b+CD11c+макрофагов, CD11B+CD11C-макрофагов и CD11Blow-CD11C+дендритных клеток. Количественная оценка интенсивности основной флуоресценции этих клеток выявила экспрессию цитоидных дендритных клеток плазмы крови и маркеров генерических дендритных клеток на клетках CD11B+CD11C+ и CD11Blow-CD11C+, при этом более высокая экспрессия обоих маркеров наблюдалась на клетках CD11Blow-CD11C+, подтверждая, что CD11Blow-CD11C+клетки на самом деле являются дендритными клетками. Гейтирование CD45-положительных клеток выявило CD19-положительные B- и CD3-положительные Т-клеточные популяции, последние из которых могут быть дополнительно подразделены на CD3+CD4+T-хелперы, CD3+CD8+цитотоксические Т-клетки, а также CD3-CD56+естественные киллеры.

Затем был рассчитан процент жизнеспособных иммунных клеток для каждого субъекта, что выявило значительное увеличение процента провоспалительных CD11B + CD11C + макрофагов в висцеральной жировой ткани взрослых мужчин с ожирением. После освоения этой техники ее можно выполнить в течение четырех часов при правильном выполнении. При попытке выполнить эту процедуру важно держать буферы и клеточные фракции на льду, а при маркировке клеток антителами очень важно держать их в темноте.

После своего развития этот метод позволил исследователям в области метаболических исследований изучить изменения иммунных клеток в жировой ткани человека. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать иммунные клетки жировой ткани и как проводить проточную цитометрию на этих клетках. Имейте в виду, что вы работаете с потенциально инфекционными материалами и веществами для человека, такими как формальдегид, которые могут быть опасны.

Всегда соблюдайте меры предосторожности, надевайте перчатки и защитные очки.