Характеристика человека моноцитов дендритные клетки путем обработки изображений проточной цитометрии: Сравнение между двумя моноцитов Isolation протоколов

Общая цель данного исследования состоит в том, чтобы сравнить два различных метода выделения моноцитов человека для получения дендритных клеток in vitro и охарактеризовать экспрессию CT11c, CT14 на клеточной поверхности полученных моноцитов с помощью проточной цитометрии с помощью визуализационной проточной цитометрии. Эти протоколы выделения моноцитов могут способствовать разработке надежных методов очистки дендритных клеток человека для исследований и клинического применения. Основное преимущество этих протоколов заключается в том, что они облегчают выделение моноцитов человека и их дифференцировку в жизнеспособные и функциональные клетки, полученные из моноцитов.

Кроме того, это первое исследование, в котором была охарактеризована конкретная популяция дендритных клеток, полученных из моноцитов, с помощью проточной цитометрии с визуализацией отдельных клеток. Этот метод также может быть применен в качестве альтернативы для выделения других редких клеток с достаточным выходом для последующих исследовательских применений. Визуальная демонстрация этих методов имеет решающее значение, поскольку безопасное обращение с образцами крови без соответствующего инструктажа и опыта может быть сложной задачей.

Начните с разбавления образца крови до соотношения один к одному с PBS в колбе T75. Затем добавьте 15 миллилитров раствора градиента плотности в 50-миллилитровую центрифужную пробирку и осторожно нанесите 25-30 миллилитров разбавленной крови на градиент. Чтобы добиться правильного разделения мононуклеарных клеток периферической крови, загрузите кровь в раствор градиента плотности быстро, но осторожно и не смешивая слои.

Разделите клетки центрифугированием с последующим переносом слоя интерфейса белых кровяных телец в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Промойте клетки два раза в PBS, повторно суспензив последнюю гранулу в 10 миллилитрах хлорида аммония и буфера для лизинга калия на 15 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Затем промойте клетки еще два раза в PBS.

Для выделения моноцитов методом адгезии культивируют от пяти до 10 до семи клеток полученной гранулы PBMC на 10 миллилитров готовой среды в новой колбе Т75 в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах углекислого газа в увлажненном инкубаторе. В конце инкубации выбросьте неадгезивные плавающие клетки и аккуратно промойте адгезивные клетки два раза PBS. Затем скармливают адгезивные клетки полной средой для культивирования клеток с добавлением GMCSF и IL4 человека и возвращают культуру в инкубатор на пять-семь дней.

Чтобы изолировать моноциты с помощью магнитной сепарации, после сбора PBMC методом разделения с помощью градиента плотности перенести слой лейкоцитов в пятимиллилитровую полистирольную пробирку и повторно суспендировать клетки в PBS в концентрации от пяти до 10-7 клеток на миллилитр. Далее добавьте в клетки 50 микролитров коктейля для обогащения моноцитов человека на миллилитр при перемешивании и инкубируйте клетки с коктейлем при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут. Затем добавьте 50 микролитров магнитных частиц на миллилитр клеток при тщательном перемешивании и инкубируйте клетки при температуре 4 градуса Цельсия в течение пяти минут.

В конце второй инкубации добавьте в ячейки PBS, чтобы довести общий объем до двух целых пяти миллилитров и перемешайте путем пипетирования два-три раза. Затем поместите полистирольную трубку в соответствующее магнитное устройство при комнатной температуре. Через две с половиной минуты, все еще находясь в магните, сцедите очищенную фракцию моноцитов в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Затем культивировали очищенные моноциты и полную среду для культивирования клеток с добавлением GMCSF и IL4 в течение пяти-семи дней, как показано выше. После семи дней дифференцировки распределите один раз по 10 из шести аликатов дендритных клеток, полученных из моноцитов, в соответствующее количество пробирок объемом одна целых пять миллилитров и добавьте 50 микролитров инактивированной теплом человеческой сыворотки в каждый образец, чтобы блокировать любые неспецифические находки. Через 10 минут центрифугируют клетки и повторно суспендируют гранулы в соответствующих флуоресцентных конъюгированных первичных антителах на 20 минут при четырех градусах Цельсия в защищенном от света месте.

Затем промойте клетки два раза в одном миллилитре PBS, суспендируя гранулы в 100 микролитрах PBS на один умножить на десять до шести клеток. Непосредственно перед анализом добавьте по одному микролитру DAPI в каждую пробирку. Затем считайте образцы на проточном цитометре с одноклеточной визуализацией в соответствии с инструкциями производителя.

В среднем, моноциты, выделенные методом адгезии, составляют примерно шесть целых двух десятых процента от общей популяции моноцитарных клеток периферической крови, в то время как моноциты, выделенные магнитной сепарацией, составляют до 25 процентов от общего количества моноцитов. Моноциты, выделенные любым из этих методов, одинаково жизнеспособны. MDDC, дифференцированные из моноцитов, очищенных обоими методами, сначала были скованы на основе DAPI-отрицательных или жизнеспособных клеток из общего количества одиночных клеток, а затем были скованы для каждой клеточной популяции.

Оба метода выделения дали низкую популяцию CD14-положительных, и оба метода дали высокую общую популяцию CD11c. Дальнейший фенотипический анализ был проведен на всех CD11c-положительных клетках, и хотя магнитная изоляция дает более высокий процент двойных положительных CD11c-положительных CD14-положительных клеток, этот эффект был незначительным по сравнению с методом приверженности. Эти двойные положительные CD11c-положительные, CD14-положительные клетки могут быть дифференцированными MDDC на ранней стадии, которые еще не сбросили моноцитарный маркер CD14.

При анализе одиночных CD11c-положительных клеток метод адгезии дает наибольший выход CD11c-положительных, CD14-отрицательных клеток. Эти одиночные положительные клетки могут быть дифференцированными MDDC на поздней стадии. После освоения техники адгезии и магнитной изоляции могут быть выполнены за три-четыре и один-два часа соответственно, если они выполнены правильно.

При попытке проведения этой процедуры важно помнить о необходимости приема свежих цитокинов дифференцировки дендритных клеток каждые 48 часов, когда среда пополняется. Работа с биологически опасными жидкостями, такими как кровь, может быть чрезвычайно вредной, поэтому при выполнении этих процедур всегда следует использовать соответствующие средства индивидуальной защиты и методы утилизации. Это исследование открывает путь для исследователей в области иммунологии к изучению использования моноцитов и дендритных клеток человека для терапевтического лечения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оптимизировать выделение моноцитов человека для создания различных популяций клеток, полученных из моноцитов, in vitro.