Высокоразмерная проточная цитометрия для анализа иммунной функции рассеченных тканей имплантата

Выделение клеток из рассеченных имплантатов и их характеристика с помощью проточной цитометрии может внести существенный вклад в понимание паттерна иммунного ответа против имплантатов. В данной работе описан точный метод выделения клеток из рассеченных имплантатов и их окрашивания для проточного цитометрического анализа.

Этот протокол может помочь нам охарактеризовать иммунный ответ хозяина против различных биоматериалов, что впоследствии может помочь в разработке лучших будущих медицинских имплантатов. Проточная цитометрия дает нам информацию об иммунных клетках, проникающих в биоматериал, что помогает нам определить механизмы того, как клетки реагируют на повреждение и имплантацию материала, а также мишени для улучшения терапии. Один и тот же протокол может быть модифицирован для характеристики иммунного ответа в различных условиях.

Препарируют четырехкратные мышцы мышей, которым неделю назад был установлен имплантат ECM, и собрали их в 50-миллилитровую пробирку, содержащую пять миллилитров безсывороточной среды. Окончательно нарезаем ткань кубиками с помощью ножниц. Затем добавьте в пробирку пять миллилитров пищеварительной ферментной среды.

Поместите пробирку с пищеварительной средой и нарезанными кубиками салфетками во встряхивающий инкубатор на 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 100 оборотах в минуту. В конце инкубации переваренную тканевую суспензию процеживают через ситечко 70 микрон в индивидуальную пробирку объемом 50 миллилитров. Используйте пятимиллилитровую головку шприца, чтобы размять любой твердый кусок ткани и промыть ситечко PBS комнатной температуры.

Выбросьте оставшиеся остатки в сетчатое фильтро и отрегулируйте объем пробирки до 50 миллилитров с помощью PBS комнатной температуры. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в 10 миллилитрах холодного пятимиллимолярного раствора ЭДТА в PBS. Если в образце присутствуют клетки крови, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера для лизиса эритроцитов, инкубируйте в течение 10 минут, затем добавьте девять миллилитров ЭДТА.

Оставьте суспензию на льду на 10 минут. Затем отрегулируйте объем до 50 миллилитров с помощью холодного PBS. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы и 100 микролитров холодного PBS.

Перелейте 10 микролитров суспензии в отдельные пробирки микроцентрифуги и смешайте с 10 микролитрами трипа и синего для подсчета. Распределите оставшийся объем ячеек в каждую лунку V-образной нижней 96-луночной пластины. Извлеките 20 микролитров клеток из лунки и добавьте их в новую лунку, чтобы использовать в качестве неокрашенного контроля.

Затем с помощью ПБС доведите окончательный объем в каждой лунке до 200 микролитров. Соберите клетки на дне пластинчатых лунок путем центрифугирования и повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах красителя жизнеспособности от одной до 1000 на лунку. По окончании инкубации промойте каждую лунку 100 микролитрами свежего ПБС и повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах окрашивающего буфера на лунку.

После второго центрифугирования ресуспендируют клетки в 50 микролитрах разведения от одного до 100 моноцитарного блокатора. Инкубируйте клеточную суспензию в течение пяти минут на льду, а затем добавьте 50 микролитров коктейля антител. Выдерживают 30 минут на льду, защищенном от света.

Затем промойте лунки 100 микролитрами красящего буфера на лунку. Снова центрифугируйте клетки и промойте 200 микролитрами красящего буфера. Повторите процесс еще два раза, после чего повторно суспендируйте клетки в 400 микролитрах окрашивающего буфера.

Перед анализом образца запустите неокрашенную выборку, чтобы можно было скорректировать популяцию клеток на диаграмме бокового рассеяния по сравнению с диаграммой прямого рассеяния. Далее запускаем окрашенный образец. Извлеките автофлуоресцентную сигнатуру.

Затем импортируйте файлы FCS, чтобы использовать их в качестве элемента управления для рассмешивания. Нажмите на значок размешивания, чтобы открыть мастер смешивания, и выполните размешивание, используя все одноцветные элементы управления, путем стробирования положительной и отрицательной популяций. Далее нажимаем на раздел QC и смотрим на индекс сложности.

Индекс сложности — это мера того, насколько различима коллекция спектральных сигнатур, когда спектральные сигнатуры не смешиваются друг с другом. Наконец, размикшируйте сэмпл, щелкнув Live Unmix. Здесь можно наблюдать результаты 14 цветовых фактов на тканях контрольной мыши.

В этом анализе можно было наблюдать несколько лоббистских популяций, таких как ly6g-положительные нейтрофилы и ly6c со средней и высокой экспрессией моноцитов. Два положительных дендритных клетки с высоким уровнем CD11c MHC были легко очевидны при стробировании против CD11b, чтобы исключить макрофаги и другие клетки миелоидной линии, такие как нейтрофилы и моноциты. Подгруппа CD206-положительных CD86-позитивных дендритных клеток может быть идентифицирована путем сосредоточения внимания на этой CD11c-позитивной популяции, которая включает в себя как CD86-высокие дендритные клетки, так и CD206-высокие популяции М2-подобных дендритных клеток.

F4/80 продемонстрировал градиент экспрессии, который обычно наблюдается в различных популяциях макрофагов. Siglec-F присутствовал как в положительной, так и в отрицательной популяциях F4-80, что, скорее всего, соответствовало субпопуляции макрофагов и эозинофилов соответственно. Несмотря на то, что окрашивание маркерами клеточной поверхности позволяет определить типы клеток, важно отметить, что клетки, экспрессирующие различные маркеры, следует рассматривать в функциональном ключе, а не в более бинарной классификации.

При использовании этого протокола имейте в виду, что понимание автофлуоресцентной сигнатуры ваших недостаточно окрашенных образцов перед проектированием панели является ключом к достижению лучшего и смешивания. Помимо анализа клеток, изолированные клетки могут быть отсортированы в определенные популяции для последующей оценки с помощью клеточных анализов, in vitro, транскриптомного анализа или микроскопического анализа для оценки клеточной морфологии. Растущая сложность анализа биоматериалов методом проточной цитометрии помогает преодолеть разрыв между фундаментальными иммунологическими исследованиями и разработкой новых терапевтических средств.