Практического использования РНК-интерференции: устные доставка двуцепочечной РНК в липосомы перевозчиков для тараканов

Общая цель этого протокола заключается в истощении экспрессии генов в кишечнике тараканов с помощью РНК-интерференции путем перорального приема двухцепочечной РНК, инкапсулированной в носители липосом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в разработке новых методов борьбы с вредителями, например, может ли сбивание основных генов в открытом грунте убить вредителей? Основное преимущество этой методики заключается в том, что липосома защищает ген-специфичную двухцепочечную РНК, обеспечивая ее доставку к клетке-мишени.

Демонстрировать процедуру будут Цзя-Синь Хуан, постдок, и Юнь Лю, техник из моей лаборатории. Для начала обезболите тараканов на льду до тех пор, пока они не перестанут двигаться в течение трех минут. Затем возьмите насекомое с помощью большого и указательного пальцев, чтобы получить доступ к его брюшной стороне.

Затем с помощью ножниц для препарирования отрежьте кончик тазобедренного сустава задней ноги между тазобедренным суставом и вертелом. Разрез в других местах тазобедренного сустава менее эффективен для скопления гемолимфы. Теперь поместите микропипетку объемом 10 микролитров в разрез и осторожно сожмите живот, втягивая кровоточащую гемолимфу.

Повторяйте этот процесс до тех пор, пока гемолимфа от пяти тараканов не будет собрана в одну микроцентрифужную пробирку. Далее кратковременно раскрутите слипшуюся гемолимфу в течение 10 секунд. Затем смешайте 10 микролитров гемолимфы с 50 микролитрами 1x солевого буфера от насекомых.

Теперь центрифугируйте разведенную гемолимфу в течение 10 минут, чтобы вытащить гемоциты из раствора. Затем переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Наконец, количественно оцените общую концентрацию белка с помощью микрообъемного УФ-ВИД спектрофотометра и отрегулируйте концентрацию каждого образца до шести миллиграммов белка на микролитр.

Чтобы собрать сок средней кишки, сначала обезболите тараканов на льду. Затем перенесите один из них на препарирующую пластину, загруженную холодным 1x буфером для солевого раствора насекомых, и с помощью булавок от насекомых закрепите его брюшной стороной вверх. Теперь рассеките брюшную полость с помощью тонкого пинцета.

Затем удалите всю кишку и переложите ее в свежее блюдо с 1x буфером для солевого раствора насекомых. Затем изолируйте среднюю кишку, которая является областью между урожаем и мальпигиевыми канальцами. Для этого нужно удалить переднюю часть животного и удалить заднюю кишку.

Затем быстро переложите среднюю кишку в микроцентрифужную пробирку со 100 микролитрами солевого буфера от насекомых. Соберите средние кишки от шести тараканов в одну трубку. Затем закрутите трубку на 10 секунд.

Далее центрифугируйте смесь в течение 10 минут, чтобы отделить гемоциты и ткани кишечника. Затем перенесите надосадочную жидкость в чистую микроцентрифужную пробирку, и отрегулируйте концентрацию до шести миллиграммов белка на микролитр. Двухцепочечные РНК-липоплексы должны быть использованы в течение часа после приготовления.

Во время их приготовления обязательно соединяйте весь разведенный реагент с разведенной двухцепочечной РНК одновременно. Затем, быстро завихрите, и инкубируйте смесь. Когда все будет готово, смешайте четыре микролитра двухцепочечного раствора РНК с 10 микролитрами солевого буфера насекомых в качестве контроля или смешайте его с 10 микролитрами экстрагированных ферментов, полученных из гемолимфы или сока средней кишки.

Затем сделайте ингибируемый ферментами контроль, добавив два микролитра EGTA. В противном случае добавьте два микролитра воды, не содержащей РНКазы. Затем инкубируйте образцы в течение часа или дольше при температуре 25 градусов Цельсия.

После инкубации добавьте 200 микролитров экстракционного реагента и 40 микролитров хлороформа, а затем вортекс. Далее центрифугируйте образцы в течение 10 минут. Затем перенесите по 150 микролитров каждой надосадочной жидкости в новую пробирку и осадите двухцепочечную РНК из каждого образца, добавив 150 микролитров изопропанола и инкубируя образцы на льду в течение 15 минут.

После инкубации снова центрифугируйте образцы и выбросьте надосадочную жидкость. Затем дважды промойте гранулы РНК, добавив 200 микролитров 70% этанола в каждую гранулу и центрифугируя пробирку. После второй промывки высушите двухцепочечные гранулы РНК с помощью центробежного вакуумного концентратора в течение трех минут.

Затем повторно суспендируйте гранулы в 10 микролитрах воды, не содержащей РНКазы. Наконец, проверьте целостность обработанной двухцепочечной РНК с помощью 1,5%-ного агарозного геля. Кормите тараканов два раза в день, через час после выключения света и за час до выключения света.

Делайте это в течение восьми или 16 дней без перерывов. В течение этого времени тараканы должны испытывать недостаток воды. Для кормления имейте в наличии свежеприготовленные липоплексы с двухцепочечной РНК и голые двухцепочечные РНК.

Для болюса используйте четыре микролитра двухцепочечных РНК-липоплексов или 250 нанограммов голой двухцепочечной РНК. Чтобы накормить таракана, сначала схватите его за крылья с помощью гибких щипцов. Не стоит хватать за части тела таракана.

каплю раствора ближе к ротовым аппаратам и наблюдайте, как таракан проглатывает каплю. После последнего кормления предоставьте тараканам бутылки с водой. В течение всего периода кормления ежедневно оценивайте насекомых, чтобы проверить их на смертность и удалить всех тараканов, которые больше не двигаются после эксперимента.

Непрерывное пероральное введение двухцепочечных липоплексов в ваннах смогло снизить экспрессию тубулина в средней кишке с 40% на девятый день до 60% на 17-й день. Для сравнения, голая двухцепочечная РНК не имела никакого эффекта. Скорее всего, это связано с тем, что воздействие на обнаженную двухцепочечную РНК соком средней кишки приводило к деградации в течение часа, в то время как двухцепочечная РНК, конъюгированная с липосомами, оставалась стабильной.

Не только уровень РНК снизился, но и непрерывное кормление двухцепочечными липоплексами тубулина РНК также привело к значительной летальности. Вряд ли это связано с вектором, так как липоплексы, несущие двухцепочечную РНК к EGFP, не приводили к летальности. При попытке использования этой системы пероральной доставки РНК-интерференции важно выполнять непрерывное кормление двухцепочечной РНК в течение нескольких дней.

После того, как вы овладеете ею, этап кормления может быть выполнен за две минуты для каждого насекомого, если он выполнен правильно. При необходимости могут быть применены различные рецептуры наночастиц липосом, чтобы улучшить процесс кормления и эффективность РНК-интерференции. В конечном счете, этот метод сделал возможным для исследователей в области борьбы с вредителями изучение новых стратегий борьбы с использованием РНК-интерференции.