Лазерная захвата Microdissection высоки чисто Трабекулярная сеть от мыши глаз для анализа выражения гена

Общей целью этой процедуры лазерной микродиссекции является разработка надежного и воспроизводимого метода выделения высокообогащенной трабекулярной сетки из глаз мыши с использованием микроскопии лазерного захвата для последующего выделения РНК и последующего анализа экспрессии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области офтальмологии, такие как важные гены и сигнальные пути, которые при неправильной регуляции могут привести к глазным заболеваниям. Основное преимущество этой методики заключается в том, что высококачественная РНК из трабекулярной сети мышиных глаз может быть воспроизводимо выделена для анализа экспрессии генов.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что лазерная микродиссекция является мощным методом, который включает в себя различные этапы устранения неполадок на протяжении всего протокола. Начните эту процедуру с оптимального забора тканей для лазерной микродиссекции, как описано в текстовом протоколе. Распылите раствор для обеззараживания РНКазы на щетку, щипцы, соединительные банки и монтажный патрон.

Тщательно протерев, промойте аппарат водой, не содержащей нуклеаз, и высушите. Протрите криостат 100% этанолом, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Выдавите небольшое количество O.C.T. на монтажный патрон, затем извлеките тканевый блок из формы и осторожно поместите блок на монтажный патрон.

Как только тканевый блок на монтажном патроне замерзнет, вставьте его в держатель образца криостата. Затем отрегулируйте криостат так, чтобы разрезать восьмимикронные срезы, и осторожно прорежьте блок O.C.T., чтобы добраться до образца ткани. Как только ткань будет осмотрена, прекратите секцию.

Обрежьте замороженные блоки со всех сторон с помощью чистого лезвия бритвы и оставьте три-четыре миллиметра O.C.T. вокруг ткани, чтобы можно было работать с кистью. Разрез через глаз, прорабатываем быстро. Покрасьте каждую третью секцию, затопив предметное стекло быстрым одноэтапным пятном H&E в течение 60 секунд.

Промойте секцию водопроводной водой и высушите на воздухе. После очистки среза очищающим средством смонтируйте срез на заряженном предметном стекле с покровным листом, рассмотрите под микроскопом. Продолжайте секцию до тех пор, пока ТМ не станет заметной на окрашенных срезах.

Как только ТМ начнет появляться, разрежьте две секции и закрепите их на заряженном предметном стекле для регулярного окрашивания H&E, чтобы сформировать карту для резки с помощью микродиссекции с лазерным захватом. После первого предметного стекла карты H&E вырежьте и выровняйте шесть последовательных секций толщиной восемь микрон в криостате и одновременно установите их на предметное стекло ПЭТ-мембраны. Приклейте ткань, кратковременно проведя большим пальцем в перчатке по задней части мембраны.

После монтажа поместите предметное стекло из ПЭТ-мембраны сразу в предметную коробку на сухой лед. Продолжайте разрезать глаз. После каждых двух предметных стекол из ПЭТ-мембраны с шестью секциями каждый, соберите две секции на заряженном стеклянном предметном стекле, чтобы создать еще одну картографическую горку для окрашивания H&E.

Продолжайте секционирование примерно 100 последовательных секций толщиной восемь микрон до тех пор, пока TM не исчезнет. Подтвердите отсутствие ТМ, быстро запачкав один участок на заряженном предметном стекле. После окрашивания предметного стекла карты H&E, как описано в текстовом протоколе, просмотрите слайды H&E визуально с помощью микроскопа.

Идентифицируйте слайды карты с памятью переводов, хорошо видимыми и доступными для резки. Используйте ПЭТ-мембранные слайды между этими слайдами карты для ЛКМ. Извлеките из морозильной камеры минус 80 градусов по Цельсию слайд-бокс с замороженными срезами салфеток и положите его на сухой лед.

Обрабатывайте слайды по одному. Зафиксируйте секции, немедленно поместив предметное стекло в холодные ингибиторы РНКазы, содержащие 75% этанол, на 30 секунд. Осторожно опустите предметное стекло в воду, не содержащую нуклеаз, на 10-15 секунд, чтобы растворить ОКТ, не мешая участкам ткани.

Осторожно нанесите пипеткой 300 микролитров 1,5%-ного раствора ацетата крезилфиолета непосредственно на срезы и инкубируйте в течение 45 секунд при комнатной температуре. Затем промойте секции один раз, поместив их в ванну с 75% этанолом на 30 секунд. Нанесите пипеткой 200 микролитров раствора Эозина Y на срезы и инкубируйте в течение трех-пяти секунд.

Обезвожьте ткань, поместив стекла в 75% этанол, 95% этанол и, наконец, ванну со 100% этанолом на 30 секунд каждое. Промокните конец предметного стекла салфеткой между каждым шагом, чтобы удалить лишнюю жидкость. Дайте слайду полностью высохнуть на воздухе под капотом в течение пяти минут.

После высыхания сразу после этого выполните LCM. Избегайте использования ксилола на последнем этапе очистки. Обработка ксилолом приведет к тому, что участок ткани будет недостаточно прикреплен к предметному стеклу мембраны.

Ксилол также снижает эффективность захвата тканей с помощью LCM. Поместите предметное стекло из ПЭТ-мембраны стороной окрашенной ткани вниз прямо на верхнюю часть нового предметного стекла, которое было загружено на предметный столик микроскопа. Убедитесь, что мембрана и предметное стекло плотно соединены друг с другом на предметном столике микроскопа.

Запустите LCM, предварительно установив пределы слайдов. Выберите минимальное 4-кратное увеличение на панели «Объектив», затем определите рабочую область предметного стекла мембраны, перемещая предметный столик XY микроскопа до тех пор, пока верхний левый угол, где встречаются металл и мембрана, не станет видимым в режиме реального времени. В этот момент нажмите кнопку Limit 1 и на карте дорог появится красный прямоугольник.

Далее переместите XY-столик в противоположный угол и нажмите кнопку Limit 2. Нажмите кнопку «Сканировать», чтобы создать изображение дорожной карты мембраны и тканей между заданными пределами. Дважды щелкните рядом с памятью переводов одного из участков глаза на карте дорог.

ТМ может располагаться вблизи вершины иридорогового угла. После того, как ТМ будет идентифицирована, увеличьте увеличение до 10X и вручную сфокусируйтесь на ТМ. Повторите то же самое с целями 20X и 40X. Когда ТМ находится в фокусе с объективом 40X, перейдите к пустой области, выберите инструмент рисования от руки и нарисуйте длинную линию на пустом участке ткани.

Установите параметры лазера так, чтобы скорость резки составляла 34%, фокус был 58%, а мощность равна 70%, а затем нажмите кнопку Cut. Выполняйте тонкую лазерную регулировку параметров скорости, фокусировки и мощности до тех пор, пока не будет видна четкая и тонкая линия реза. Для точной резки убедитесь, что резка следует за нарисованной линией.

Затем загрузите крышку изолирующей трубки в держатель крышки и откройте трубку. Прикрепите держатель крышки к подъемнику крышки и убедитесь, что трубка перевернута. Также убедитесь, что материал клейкого колпачка выступает за пределы кончика колпачка, чтобы обеспечить надлежащий захват нужной ткани.

Очень важно визуально убедиться, что трабекулярная сетка захвачена и прикреплена к изоляционному колпачку. Выберите режим «Ручное рассечение» на панели программного обеспечения. Внимательно убедитесь, что ТМ находится непосредственно под изолирующей трубкой.

Установите баланс белого и отрегулируйте яркость, чтобы получить оптимальное качество изображения. Чтобы начать резку, вручную отрегулируйте фокус и нарисуйте линию с помощью инструмента «От руки». Следите за тем, чтобы колпачок для сбора оставался в верхнем положении, еще не касаясь мембраны.

Нарисуйте частичные круги рядом с местом встречи ТМ со склерой и нажмите Вырезать. Как только первые надрезы будут сделаны, установите колпачок в нижнее положение и снова отрегулируйте фокус, затем проведите две линии в открытом или свободном пространстве, чтобы соединить два частичных круга, завершая круг вокруг ТМ. Затем нажмите кнопку Cut и соберите ткань с разреза. Убедитесь, что ТМ была захвачена колпачком для микродиссекции.

Установите колпачок обратно в верхнее положение и повторите для остальных секций. Слегка отрегулируйте положение колпачка так, чтобы все изолированные образцы поместились на колпачке и не перекрывались. Для следующей мембраны из ПЭТ вставьте новую изолирующую трубку и повторите этот раздел.

Для проведения лизиса микрорассекаемой ткани ТМ необходимо осторожно нанести пипеткой 10 мкл буфера для лизиса на крышку пробирки для сбора, следя за тем, чтобы буфер для лизиса полностью покрывал микрорассекаемую ТМ. Аккуратно закройте клейкий колпачок и выдержите пробирку для сбора вверх дном при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации центрифугируйте при 800 г в течение двух минут и поместите лизат на сухой лед. Храните лизаты при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующей очистки и анализа.

Быстрая деградация РНК может повлиять на анализ РНК ниже. Качество РНК следует измерять и количественно оценивать с помощью платформы на основе микрофлюидики. Представлены репрезентативные результаты анализа экспрессии генов высококачественной общей РНК, выделенной из трабекулярной сети.

Цифровой гель для оставшейся общей РНК из тканей глаза после лазерной микродиссекции показывает высокое число целостности РНК, которое необходимо для последующего анализа РНК. После извлечения качественной РНК из ткани можно провести последующий анализ, такой как микрочип, RNA-Seq и кПЦР. В данной работе был использован количественный цифровой ПЦР-анализ для анализа экспрессии генов, связанных с трабекулярной сетью, миоцилина и ACTA2 из РНК, собранной методом LCM.

Тепловая карта, созданная на основе данных, полученных в результате анализа микрочипов, иллюстрирует, что этот метод может быть использован для понимания изменений экспрессии генов в трабекулярной сети мышей дикого типа и мышей с нокаутом с повышенным фенотипом ВГД. После освоения этой техники ее можно выполнить всего за один день на биологическом животном, если все сделать правильно. Визуальная демонстрация этого метода имеет важное значение, поскольку этапы лазерной микродиссекции трудно освоить из-за сложности визуализации интересующих клеток и отсутствия стандартов для этих уникальных образцов.

Очень важно полагаться на квалифицированного оператора. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что РНК в небольших количествах тканей может быстро разрушаться. Следует принимать меры предосторожности, такие как обеззараживание оборудования от РНКазы, сведение к минимуму контакта с воздухом и поддержание холода в тканях.

Хотя этот метод может дать представление о влиянии повышенного внутриглазного давления на экспрессию генов, специфичных для трабекулярной сети, он также может быть применен к другим системам, таким как оценка изменений в экспрессии генов в сетчатке, вызванных повышенным внутриглазным давлением. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как RNA-Seq или микрочип, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие сигнальные пути изменены в трабекулярной сети мышей с повышенным внутриглазным давлением. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей к более эффективному изучению изменений экспрессии генов в трабекулярной сети в мышиных моделях.