Лазерная микродиссекция Применительно к экспрессии генов Профилирование подмножество ячеек из Drosophila Крыло диска

В данной работе представлено детальное описание метода лазерной микродиссекции, применяемого для сравнительного профилирования транскриптов РНК в зонах с подавленной и неподавленной экспрессией в имагональном диске крыла дрозофилы. В качестве биологического материала требуются вручную выделенные имагональные диски дрозофилы; основным оборудованием является лазерный микродиссектор. Мы используем систему LI A-L-L-M-D 6, 000 и аппарат для ПЦР в реальном времени.

Мы использовали систему BioRad iq. Для работы требуются пять небольших инструментов: вогнутая пластина, маленькая кисть, микродиссекционные пинцеты, предметное стекло для метода висячей капли, энтомологические пинцеты, закрепленные на иглах шприца, металлическая рамка с ПЭТ-мембраной и маленькие пластиковые пробирки. Данный метод включает следующие этапы.

Шаг первый: скрещивание двух подходящих трансгенных линий Drosophila для инициации локального и специфического сайленсинга генов у потомства с использованием системы GAL4/UAS. Шаг второй: подготовка рамок для диссекции. Шаг третий: настройка лазерного микродиссектора.

Шаг четыре: вручную собрать имагинальные диски крыла из личинок, полученных в результате генетического скрещивания. Шаг пять: выполнить лазерную микродиссекцию специфических участков имагинальных дисков, меченных GFP. Шаг шесть: профилирование транскрипции эквивалентных участков сайленсированных и несайленсированных областей диска позволит установить эффекты, вызванные сайленсированием интересующего вас гена.

Для профилирования транскрипции гена X in vivo потребуется экстракция РНК из микродиссекированных участков, контроль точности ручного диссекирования, оценка экспрессии GFP в двух образцах с помощью R-T-P-C-R, количественное определение экспрессии предполагаемых мишеней сайленсированного гена в двух образцах с помощью ПЦР в реальном времени (real time R-T-P-C-R) или путем проведения микрочипового анализа. Ниже представлены подробности каждого этапа.

Первый этап — генетический скрещивание. Генетическое скрещивание проводится с использованием трансгенных линий GAL4 UAS и направлено на получение личинок с сайленсингом в имагинальных дисках. Универсальная система GAL4 позволяет вызывать специфический и локализованный сайленсинг генов посредством РНК-интерференции.

Один штамм вводит в скрещивание драйверный трансген, который экспрессирует GAL4 в определенном временном или пространственном паттерне, и репортер UAS-GFP, позволяющий визуализировать область экспрессии GAL4. Второй штамм вводит респондерный трансген UAS, который экспрессирует шпилечную сайленсирующую РНК, способную специфически воздействовать на ген X после экспрессии в клетке.

Эта РНК расщепляется с образованием малых интерферирующих РНК, которые способны специфически подавлять экспрессию выбранного гена X в потомстве данного скрещивания. Трансген сайленсинга UAS транскрибируется только в тех клетках, которые экспрессируют белок GAL4, что вызывает пространственно ограниченное подавление гена X. Из множества возможных применений мы сосредоточились на профилировании транскриптов РНК в имагинальном диске крыла с сайленсингом под действием драйвера Grailed GAL4, который обеспечивает специфическое подавление в заднем компартменте.

Область сайленсинга отмечена экспрессией трансгена U-A-S-G-F-P в заднем отделе. Два события инициируют экспрессию GGFP и сайленсинг гена x.

Шаг второй: обработка рамок для диссекции с целью ингибирования активности РНКаз. Промойте предметные стекла рамок и инструменты для диссекции водой с DEPC в течение не менее одного часа при комнатной температуре, после чего дайте им высохнуть в стерильной камере. Чтобы подавить активность РНКаз, используйте новую пробирку объемом 50 мл, предварительно очищенную от РНКаз и заполненную водой с DEPC; поместите в пробирку пинцет, предметное стекло для метода висячей капли и рамку для ПЭТ.

Оба необходимы для микродиссекции. Закройте пробирку, переверните ее вверх дном и оставьте для протекания реакции минимум на один час при комнатной температуре. Через один час перенесите воду с DEPC в другую пробирку с помощью пинцета.

Удерживайте предметные стекла внутри пробирки, чтобы они не выпали. Затем дайте стеклам высохнуть внутри пробирки. Шаг три: подготовка к микродиссекции.

Сначала включите все необходимые устройства: флуоресцентную лампу, микроскоп и программное обеспечение для микродиссекции. Окно с предупреждением напомнит вам о необходимости включить лазер. Сделайте это и дайте лазеру прогреться, пока вы завершаете подготовку к микродиссекции.

Теперь необходимо подготовить лунки для сбора тканей. Оборудование для лазерной микродиссекции Leica LMD 6,000 позволяет загружать до четырех пробирок для сбора различных образцов. Для нашей цели потребуются всего две пробирки.

Одну трубку используют для сбора GFP-положительной ткани с подавленным геном, другую — для сбора GFP-отрицательной ткани без подавления с помощью микроманипулятора. Наполните обе крышки трубок 20 µL раствора TRI-реактива для сохранения RNA. Теперь инструмент для микродиссекции готов к использованию. Шаг четыре: ручное выделение имагинальных дисков крыльев из личинок Drosophila.

Выделите крыловые диски из личинок потомства, полученных по ранее описанному методу; при этом убедитесь, что другие ткани не загрязняют диски. Для достижения этой цели используется метод диссекции, который существенно отличается от того, что обычно применяется для сбора всей совокупности исходных дисков. Сначала промойте личинку в растворе Рингера, чтобы удалить прилипшую питательную среду. Затем перенесите её на предметное стекло с висячей каплей и немедленно отсеките голову, потянув ротовой аппарат вниз.

Используя энтомологические булавки, аккуратно отделите остальные ткани. Красным контуром выделены имагинальные диски крыльев, которые необходимо собрать. Очистите диски от прилегающих тканей, действуя быстро и осторожно. Перенесите каждый изолированный диск крыла на предметное стекло с рамкой для диссекции, чтобы незамедлительно приступить к разрезанию.

Эту процедуру необходимо повторять до тех пор, пока не будет набрано в общей сложности сто примордиальных дисков крыльев. Шаг пять: лазерная микродиссекция специфических областей меченых GFP дисков крыльев. Как только исходный диск крыла окажется на мембране, можно приступать к разрезанию.

Поместите рамку в держатель и закрепите держатель на моторизованном предметном столике. Найдите исходный диск крыла, используя LMD 6, 000 в режиме обычного микроскопа. Сфокусируйтесь на объекте и установите плоскость среза.

Начертите овальную область, которая охватит обе стороны диска: как GFP-положительную, так и другую. Выберите крышку пробирки, в которой вы хотите собрать GFP-положительную фракцию. Нажмите кнопку Start cut.

Микродиссектор приступает к разрезанию ткани со скоростью и мощностью, которые вы установили ранее, выбрав функцию «перемещение и резка» (move and cut). Вы можете доработать разрез вручную до тех пор, пока не отделится невыбранный фрагмент ткани. 3D-анимация демонстрирует процесс работы микродиссектора: лазер фокусируется на ткани, совершая разрез вдоль выбранного периметра.

После выполнения среза фрагмент ткани попадает в выбранную крышку пробирки и, следовательно, в раствор tri Reagent. После первого среза переместите область реза на другую сторону диска крыла, чтобы отсечь эквивалентную область, отрицательную по GFP. Перед выполнением нового среза обязательно выберите другую крышку пробирки, чтобы разделить ткани, положительные по GFP, и ткани, отрицательные по GFP.

После автоматического разреза нажмите кнопку начала реза. Перейдите к ручной доводке реза, как показано в 3D-анимации перед вторым разрезом. Моторизованный стол перемещает выбранную крышку пробирки в зону реза.

Лазерный луч фокусируется на ткани вдоль выбранного периметра, и после завершения разреза фрагмент ткани попадает в выбранную крышку пробирки, содержащую реагент Tri. Для сбора достаточного количества материала мы повторили процедуру на ста дисках имагинальных крыльев. После сбора образцов выгрузите пробирки.

Это ответственный этап, на котором можно потерять все результаты проделанной ранее работы. Поэтому будьте осторожны. Закройте крышку в перевернутом виде и приступайте к эксперименту.

Здесь представлен образец с GFP-положительной тканью. А здесь — другой образец с GFP-отрицательной тканью. Шаг шесть: профилирование транскрипции.

Центрифугируйте пробирки, чтобы отделить жидкость от крышки, и добавьте реагент Try до объема 1 mL. Выполните экстракцию РНК согласно стандартному протоколу с использованием реагента Try для ста участков площадью примерно 5 000 µm² каждый. Наш выход составил 1.5 µg РНК.

Мы использовали in vitro транскрипцию для синтеза CD NA со случайным гексамером. Точность ручного препарирования контролировали путем проверки экспрессии GFP в двух образцах с помощью ОТ-ПЦР. Результаты представлены на геле с количественной ОТ-ПЦР.

Мы оценили уровни экспрессии замолкнувшего гена X вместе с уровнями экспрессии возможных предполагаемых мишеней регуляторного пути, опосредованного геном X. На данной диаграмме представлен пример уровней экспрессии гена X и одной из его предполагаемых мишеней. Назовем их генами Y относительно их базальных уровней экспрессии в переднем и заднем компартментах недифференцированных имаго-дисков крыла.

Было обнаружено, что при сайленсинге активность выбранного гена X снижалась до 40%. Напротив, один из его предполагаемых мишеней, ген Y, был значительно активирован (увеличение в семь раз), что позволило нам подтвердить гипотезу о том, что он подвергается негативному регулированию со стороны гена X. Мы пришли к выводу, что вышеописанный экспериментальный подход может быть успешно применен для валидации предполагаемых мишеней в различных регуляторных путях.