Лазерная микродиссекция Применительно к экспрессии генов Профилирование подмножество ячеек из Drosophila Крыло диска

В данной статье мы подробно описываем лазерную микродиссекцию, применяемую для достижения сравнительного профилирования транскрипта РНК с тишиной и без тишины на диске крыльев дрозофилы. Такой подход требует в качестве биологического материала, вручную препарированных дисков изображения дрозофил в качестве основного оборудования, лазерного микродиссектора. Мы используем LI A-L-L-M-D 6, 000 и ПЦР-машину в реальном времени.

Мы использовали IQ BioRad. Пять небольших необходимых инструментов – это вогнутая пластина, небольшая кисть, микродиссекционные щипцы, висящие капельные стекла от насекомых, насаженные на шприц, иглы, металлический каркас с пет-мембраной, небольшие пластиковые трубки. Этот метод включает в себя следующие этапы.

Шаг первый: скрещивание двух подходящих трансгенных линий oph для запуска локализованного и специфического сайленсинга гена в потомстве, использующем систему GAL four UAS. Шаг второй, для обработки рассекаемых рамок. Шаг третий, настройка лазерного микродиссектора.

Шаг четвертый, чтобы вручную собрать имагинальные диски крыльев у личиночного потомства генетического скрещивания. Шаг пятый, чтобы выполнить лазерную микродиссекцию определенных областей имагинальных дисков, меченных GFP. Шаг шестой, транскрипционное профилирование эквивалентных областей молчащих и нетвердых участков диска позволит установить эффекты, вызванные сайленсингом интересующего вас гена.

Назовем это геном X in vivo, транскрипционное профилирование потребует экстракции РНК из микродиссектированных областей, контроля точности ручного вскрытия, оценки экспрессии GFP в двух образцах с помощью R-T-P-C-R, количественной оценки экспрессии предполагаемых. Мишени гена тишины в двух образцах методом R-T-P-C-R в реальном времени или с помощью анализа микрочипов. Теперь более подробно о каждом шаге.

Первый шаг, генетическое скрещивание. Генетическое скрещивание включает в себя четыре трансгенных штамма UAS GAL и направлено на получение молчащих имагинальных дисков в личиночном потомстве. Система Versatile GAL four позволяет запускать специфическое и локализованное подавление экспрессии генов с помощью РНК-интерференции.

Один штамм вводит в скрещивание драйверный трансген, который экспрессирует GAL 4 в определенном временном или пространственном паттерне. И репортер A-U-A-S-G-F-P, который позволяет визуализировать область экспрессии GAL four. Второй штамм вводит трансген-ответчик UAS, который экспрессирует РНК, способную специфически нацеливаться на ген X, однажды экспрессированный в клетке.

Эта РНК расщепляется с образованием небольшой интерферирующей РНК, которая способна специфически подавлять выбранный ген X в потомстве этого скрещивания. Трансген подавления UAS транскрибируется только в тех клетках, которые экспрессируют белок GAL 4, тем самым вызывая пространственно ограниченное подавление гена X. Среди разнообразия применений мы сосредоточились на профилировании РНК-транскриптов в межкрыльевом диске, заглушенном драйвером Grailed GAL 4, который направляет специфическое сайленсинг в заднем отделе.

Область тишины отмечена экспрессией трансгена U-A-S-G-F-P. В заднем отделе. Два события будут вызваны экспрессией GGFP и подавлением гена x.

Шаг второй, обработка диссекционных рамок для подавления активности РНК. Промойте предметные стекла рамы и инструменты для вскрытия водой DEPC в течение не менее одного часа при комнатной температуре и дайте им высохнуть в стерильной камере. Чтобы подавить активность РНК, используйте совершенно новую пробирку объемом 50 мл, уже свободную от РНК, заполненную водой DEPC с вставленными в пробирку щипцами, подвесным предметным стеклом и рамкой для домашних животных.

Оба необходимы для микродиссекции. Закройте трубку, переверните ее вверх дном, затем оставьте реагировать как минимум на один час. При комнатной температуре, через час, переместите воду DEPC в другую трубку с помощью щипцов.

Удерживайте предметные стекла внутри трубки, чтобы они не упали. Затем дайте предметным стеклам высохнуть внутри трубки. Шаг третий, настройка микродислекта.

Во-первых, включите все необходимые приборы, флуоресцентную лампу, микроскоп и программное обеспечение для микродиссекции. Предупреждающее окно напомнит вам о необходимости включить также лазер. Сделайте это и дайте лазеру нагреться, пока вы закончите настройку микродислекта.

Теперь пришло время подготовить лунки, в которые нужно собрать ткани. Резать. Оборудование для лазерной резки Leica LMD 6,000 позволяет загружать до четырех пробирок для сбора различных образцов. Для нашей цели нам понадобятся всего две трубки.

Во-первых, для сбора GFP положительной тишины ткани, другой для сбора GFP отрицательной униальной ткани с микрогрудной клеткой. Заполните обе крышки пробирок 20 микролитрами раствора триреагента, чтобы сохранить РНК. Теперь микродиссект готов к использованию Шаг четвертый, ручное препарирование дисков визуализации крыльев от личинок joof.

Изолируйте диски крыльев из личиночного потомства, полученного как описано ранее, и убедитесь, что другие ткани не загрязняют диски. Для достижения этой цели подход к препарированию сильно отличается от того, который обычно используется для сбора основной массы всех исходных дисков. Сначала промойте личинку в растворе Рингера, чтобы удалить прилипшие среды. Затем переложите его в висячую каплю горки и отрежьте голову сразу, потянув рот вниз.

С помощью булавок от насекомых теперь аккуратно рассекайте другие ткани. Красным контуром обозначены имагинальные диски крыльев, которые нужно собрать. Держите диски свободными от прилипшей ткани быстро и аккуратно Перенесите каждый изолированный диск крыла в раму для немедленного разреза.

Эту процедуру нужно повторять до тех пор, пока не будет достигнуто общее количество дисков в сотню крыльев. Шаг пятый, лазерная микродиссекция определенных участков крыльевых дисков, меченных GFP. Как только оригинальный диск крыла окажется на мембране, можно приступать к резке.

Наденьте раму на ее держатель и закрепите держатель на моторизованной сцене. Ищите оригинальный диск крыла, используя LMD 6,000 в качестве обычного микроскопа. Сосредоточьтесь на нем и установите срез.

Нарисуйте овальную область, которая будет помещаться с обеих сторон диска, положительной GFP и другой. Выберите колпачок трубки, на который вы хотите собрать положительную часть GFP. Нажмите кнопку «Старт резать».

Микродиссектор Продолжает резку ткани со скоростью и мощностью, которые вы установили ранее, выбрав функцию, перемещение и разрезание. Вы можете доработать рез вручную до тех пор, пока не упадет невыбранный кусок ткани. В 3D анимации показано, что происходит под микросектором разреза лазером, фокусирующимся на ткани, делая разрез по выбранному периметру.

После того, как разрез сделан, кусочек ткани попадает в выбранную крышку пробирки и, следовательно, в триреактив. После первого разреза переместите область резки с другой стороны диска крыла, чтобы вырезать эквивалентную отрицательную область GFP. Прежде чем приступить к новому разрезу, обязательно выберите другую крышку пробирки, чтобы отделить GFP-положительные ткани от GFP-отрицательных.

Нажмите кнопку запуска резки после автоматической резки. Приступайте к доработке разреза вручную, как показано на 3D-анимации перед вторым монтажом. Моторизованный предметный столик перемещает выбранную крышку трубки под зону разреза.

Лазерный луч фокусируется на разрезе ткани по выбранному периметру, и как только разрез сделан, кусочек ткани попадает в выбранную крышку пробирки, содержащую реагент Tri. Чтобы собрать достаточно материала, мы повторили процедуру на сотне имагинальных дисков крыльев. После того, как вы соберете образцы, выгрузите пробирки.

Это деликатный шаг, из-за которого вы можете потерять всю работу, которую вы сделали до сих пор. Так что будьте внимательны. Закройте колпачок вверх ногами и приступайте к эксперименту.

Это тот, у которого GFP-положительная ткань. Это другой пациент с отрицательной тканью GFP. Шаг шестой, профилирование транскрипции.

Вращайте трубки, чтобы отделить жидкость от крышки, и добавьте реагент Try до одного миллилитра. Проводите экстракцию РНК в соответствии со стандартным протоколом пробных реагентов из ста областей площадью около 5000 микрометров в квадрате каждая. Наш выход составил 1,5 микрограмма РНК.

Мы используем надстрочный индекс три in vitrogen для синтеза CD NA со случайным гекса. Точность ручного вскрытия контролировали путем проверки экспрессии GFP в двух образцах с помощью R-T-P-C-R. Как показано в геле с количественным R-T-P-C-R.

Мы оценили уровни экспрессии гена молчания X вместе с возможными предполагаемыми мишенями регуляторного пути, опосредованного геном X. На этой диаграмме показан пример уровней экспрессии гена X и одной из его предполагаемых мишеней. Назовем их генами Y в отношении их базальных уровней экспрессии в передних задних отделах нетвердых дисков крыльев.

Было обнаружено, что активность выбранного гена X снижается до 40% после сайленсинга. Напротив, было обнаружено, что одна из его предполагаемых мишеней, ген Y, значительно повышает регуляцию в семь раз, что приводит нас к подтверждению гипотезы о том, что он отрицательно регулируется геном X. Мы приходим к выводу, что описанный выше экспериментальный подход может быть успешно применен для валидации предполагаемых мишеней на различных регуляторных путях.