Свет лист микроскопии для трехмерной визуализации иммунных клеток человека

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, например, как именно иммунные клетки ведут себя в физиологически значимом контексте, например, как эффективно искать клетки-мишени в трехмерной среде. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он создает очень тонкий слой света, который освещает только фокальную плоскость, не затрагивая ячейки внеплоскости. Это обеспечивает очень высокую скорость сбора данных с выраженным снижением обесцвечивания и фотоцитотоксичности.

Демонстрировать эту процедуру будет доктор Ренпин Чжао, постдок из моей лаборатории. Для начала под колпак для клеточных культур переложите 400 микролитров охлажденного исходного раствора коллагена в стерильную 1,5-миллилитровую пробирку. Медленно добавьте 50 микролитров охлажденного 10X PBS.

Затем перемешайте раствор, аккуратно наклоняя трубку. Добавьте 48 микролитров 0,1 молярного гидроксида натрия в раствор коллагена, чтобы довести pH до 7,2-7,6. Используйте тест-полоски для определения значения pH смеси.

Добавьте два микролитра стерильной дистиллированной деионизированной воды, чтобы довести итоговый объем до 500 микролитров. Хорошо перемешайте и храните коллагеновый раствор на льду или при четырех градусах Цельсия до дальнейшего использования. После флуоресцентного мечения живых клеток по текстовому протоколу, под колпак для клеточных культур, перенесите по одной раз от 10 до шестой клетки в стерильную пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Центрифугируйте пробирку при 200 умноженных на г в течение восьми минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость и используйте 200 микролитров питательной среды для ресуспендирования гранулы. Добавьте в клеточную суспензию 85,9 микролитров нейтрализованного раствора коллагена и тщательно перемешайте, чтобы достичь концентрации коллагена 2,5 миллиграмм на миллилитр.

Оставьте клеточную коллагеновую смесь на льду в капюшоне. Затем вставьте поршень в соответствующий капиллар до тех пор, пока поршень не будет торчать на один миллиметр из капилляра. Затем намочите поршень, опустив в питательную среду.

Пропуск этого шага может привести к нежелательному попаданию пузырьков воздуха между поршнем и коллагеновой матрицей. Окуните капилляр в клеточную коллагеновую смесь и медленно оттяните поршень назад на 10 – 20 миллиметров. Затем с помощью пульверизатора с 70%-ным этанолом смочите бумажное полотенце и с его помощью протрите наружную стенку капилляра, чтобы удалить остатки коллагенового раствора.

Теперь с помощью пластилина можно закрепить капилляр на внутренней стенке пятимиллилитровой трубки. Протолкните клеточную коллагеновую смесь к краю капилляра. Затем инкубируйте пробирку с капилляром при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение одного часа, чтобы полимеризовать коллаген.

После инкубации добавьте в пробирку один-два миллилитра питательной среды. Затем осторожно вытолкните полимеризованный коллагеновый стержень в среду до тех пор, пока примерно половина коллагена не будет висеть в среде. Инкубируйте капилляр еще 30 минут.

Чтобы провести светолистовую микроскопию, соберите камеру для образцов в соответствии с инструкциями производителя. После включения микроскопа и инкубатора при визуализации в реальном времени поместите капилляр в камеру для образца, найдите образец и найдите область, представляющую интерес для получения изображения. Активируйте соответствующие лазеры.

Затем установите мощность лазера и время экспозиции. Также задайте размер шага стека Z, начальную и конечную позиции стека Z, а также временной интервал для визуализации живых клеток. Затем начните получение изображения.

Перелейте один миллилитр 4%-ного параформальдегида в PBS в пятимиллилитровую пробирку под химическим колпаком. Затем опустите капилляр с полимеризованным коллагеном в раствор параформальдегида и с помощью пластилина закрепите капилляр на внутренней стенке трубки. Аккуратно нажимайте на поршень до тех пор, пока половина коллагенового стержня не будет висеть в растворе параформальдегида.

Затем потяните поршень назад, чтобы вывести коллагеновый стержень обратно в капилляр. Удалите капилляр из трубки и выбросьте параформальдегид. Вставьте капилляр в свежую трубку и добавьте один миллилитр PBS.

Убедитесь, что капилляр погружен в PBS. Аккуратно нажимайте на поршень до тех пор, пока половина коллагенового стержня не будет висеть в растворе, и выдерживайте в течение пяти минут. Оттяните поршень назад, чтобы впитать коллагеновый стержень в капилляр.

Затем замените PBS свежим PBS и вытолкните коллагеновый стержень в раствор. После третьей промывки добавьте в пробирку один-два миллилитра блокирующего пермеабилизационного буфера. Вытолкните коллагеновый стержень в раствор и инкубируйте пробирку при комнатной температуре от 30 до 60 минут.

Замените блокирующий пермеабилизационный буфер 200-500 микролитрами первичных антител в блокирующем пермеабилизационном буфере и инкубируйте погруженный коллагеновый стержень в раствор в течение одного часа. После использования PBST для трехкратной промывки коллагенового стержня инкубируйте стержень во вторичных антителах в блокирующем буфере для пермеабилизации при комнатной температуре в течение одного часа. После еще трех промываний в PBS втяните коллагеновый стержень обратно в капилляр и удерживайте образец в PBS до визуализации.

Как показано в этом фильме, во время миграции CTL-клетки, трансфицированные слитым актиновым белком EGFP, образовали крупные выступы в форме лимона, окаймленные тонкими веретенообразными структурами. Траектории CTL проиллюстрированы здесь с помощью скорости и настойчивости или смещения, деленного на общую длину гусеницы в качестве измеряемых параметров. Скорости варьируются от 0,01 до 0,19 мкм в секунду с почти 20-кратной разницей, а персистенция колеблется от нуля до 0,7.

На этом рисунке показаны неподвижные клетки CTL в 3D коллагеновом геле, окрашенные на эндогенные перфорин-1 и актин. Подсвечивался образец с одной стороны или с обеих сторон. С разных Z-позиций клетки равномерно окрашиваются, что свидетельствует о хорошем проникновении антител в коллагеновые гели.

Фиксированный CTL демонстрировал ту же морфологию, что и живые клетки, что указывает на то, что морфология хорошо поддерживается с помощью этого протокола. При попытке выполнить эту процедуру очень важно помнить о том, что нужно избегать пузырьков воздуха и правильно регулировать значение pH. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как окрашивание живых клеток определенными поверхностными молекулами, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как коррелировать поведение клетки с дифференцировкой или с различными подтипами клеток, или исследовать межклеточное взаимодействие и судьбу клеток.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии, иммунологии и исследований рака для изучения клеточного поведения, судьбы клеток, дифференцировки и клеточного взаимодействия в наиболее физиологически значимой системе in vitro. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как готовить образцы с клетками, встроенными в трехмерную коллагеновую матрицу, как визуализировать образцы с помощью световой листовой микроскопии, как живой, так и фиксированной, и как отслеживать миграцию клеток в 3D.