Рассечение Enhancer функции мультиплексной основанный ТРИФОСФАТЫ Enhancer вмешательства в клеточных линиях

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области геномики и регуляции генов, например, как несколько регуляторных областей генов, также известных как энхансеры, работают вместе, чтобы контролировать транскрипцию. Основное преимущество этого метода заключается в том, что несколько энхансеров рядом с несколькими разными генами могут быть протестированы одновременно, чтобы быстро идентифицировать области, участвующие в регуляции генов. Чтобы начать разработку РНК, сначала сгенерируйте последовательности ДНК, как описано в текстовом протоколе.

Используйте такую программу, как E-CRISP, на сгенерированных последовательностях ДНК, чтобы найти направляющие РНК с низким уровнем нецелевых показателей. Направляющие РНК состоят из 20 нуклеотидов, расположенных выше протоспейсер-смежного мотива, который принимает форму NGG для dCas9 от S.pyogenes. На сайте E-CRISP выберите интересующий организм с помощью выпадающего меню.

Сборка генома отображается справа от названия вида. Выберите переключатель Вход — это последовательность FASTA. Скопируйте последовательности FASTA сверху и вставьте их в диалоговое окно.

Убедитесь, что для каждой последовательности включен заголовок FASTA. В выпадающем меню выберите средний переключатель и вариант «Одинарный». Нажмите кнопку «Начать поиск одиночной гРНК».

Откроется новая вкладка браузера и отобразятся результаты. Загрузите последовательности-кандидаты, нажав кнопку «Скачать формулированный табличный отчет Excel» для всех последовательностей запросов вместе. Затем используйте браузер генома UCSC для BLAT кандидата на полноразмерные последовательности направляющей РНК в геном.

В браузере перейдите на веб-сайт браузера генома UCSC. В разделе «Наши инструменты» найдите слово BLAT и нажмите на него. Откроется инструмент поиска BLAT.

Используйте выпадающие меню, расположенные под текстом поиска генома BLAT, чтобы выбрать интересующий вас организм и сборку генома. Скопируйте последовательности направляющих РНК из табличного отчета, сгенерированного E-CRISP, и вставьте их в диалоговое окно. Убедитесь, что каждая последовательность имеет уникальный заголовок FASTA, затем нажмите кнопку «Отправить» в нижней части диалогового окна.

На странице результатов поиска BLAT будут отображаться выравнивания каждой последовательности направляющей РНК, где каждая линия представляет выравнивание. В идеале для каждой направляющей РНК должно быть одно выравнивание, указывающее на уникальность этой направляющей РНК. По возможности избегайте руководств, которые сопоставляют несколько мест в геноме.

Чтобы изучить локализацию и распределение направляющих РНК в интересующей области, нажмите на ссылку браузера в разделе «Действия» для одной из запрашиваемых направляющих РНК. Появится браузер генома, который будет центрирован на выбранной направляющей РНК. Используйте кнопки уменьшения масштаба в верхней части страницы, чтобы визуализировать распределение других направляющих РНК, идентифицированных E-CRISP, в интересующей области.

Выберите четыре, предпочтительно неперекрывающиеся, направляющие РНК, которые распределены по всей интересующей области. Если интересующая область превышает 600 пар оснований, рассмотрите возможность добавления одного-двух дополнительных ориентиров. Избегайте направляющих РНК с гомополимерными растяжками и экстремальным содержанием GC, так как эти особенности могут затруднить процесс клонирования направляющей РНК и снизить эффективность нацеливания на направляющую РНК.

Восстановите олигопласты направляющей РНК в конечной концентрации 100 микромоль в сверхчистой воде. Для каждой области интереса должно быть не менее четырех отдельных олигонолигонов направляющей РНК. Для каждой области регулирования создайте пул всех олигонопластов, соответствующих области интереса.

В пробирке Эппендорфа смешайте по пять микролитров каждого отдельного восстановленного олиго направляющей РНК для каждой области. Хорошо перемешайте бассейн путем вортекса, затем удалите один микролитр и разведите этот элокват 1:200 в ультрачистой воде. Проведите короткую ПЦР с праймерами USICS, чтобы прикрепить участки гомологии к олигону, как описано в текстовом протоколе.

К каждому олигопласту будет добавлено около 40 оснований, что даст приблизительно 100 произведений пар оснований, которые содержат достаточную гомологию спектру USIC на обоих концах. Далее настройте реакции Gibson Assembly на льду. Используйте 50 нанограмм расваренного вектора и семь нанограммов вкладыша в реакции объемом 20 микролитров.

Кроме того, настройте реакцию сборки Гибсона только с использованием вектора с использованием 50 нанограммов вектора и заменой вставки водой. Инкубируйте реакции сборки Гибсона в течение 15 минут при температуре 50 градусов Цельсия, а затем удерживайте при температуре 4 градуса Цельсия. Переложив собранные изделия в лед, разведите их в соотношении 1 к 4 в сверхчистой воде на льду.

Например, добавьте пять микролитров продукта Gibson Assembly в 15 микролитров сверхчистой воды. Далее преобразуйте разведенные изделия Gibson Assembly. Вываливайте высокоэффективные компетентные клетки на лед, и делайте 25 микролитров эломатов на каждое превращение.

Если требуется сложный пул, нацеленный на несколько сайтов, поместите достаточное количество клеток в разные пробирки для выполнения нескольких независимых преобразований. Поместите в тарелку 50 микролитров трансформированных клеток и поместите пластины в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на ночь. Для мини-подготовки бассейнов, нацеленных на отдельные участки, поместите клетки непосредственно в три-пять миллилитров бульона LB, содержащего ампициллин или карбенициллин.

Инкубируйте клетки в течение ночи при встряхивании при 250 оборотах в минуту и 37 градусах Цельсия. Для больших библиотек используйте скребок для тарелок, чтобы собрать все колонии с каждой отдельной тарелки в одну макси-преп. Этому можно способствовать, если налить примерно пять миллилитров LB с соответствующим антибиотиком в 15-миллилитровую трубку Falcon и соскоблить колонии в трубку.

За день до трансфекции поместите клетки в 24-луночный планшет с конфлюенцией от 30 до 50%. Пластины должны быть достаточным количеством клеток, чтобы трансфекцию можно было выполнять в двух экземплярах, и включать лунки для трансфекции контрольными направляющими РНК. Убедитесь, что ячейки равномерно распределены по лунке, осторожно встряхивая пластину после покрытия ячеек.

Встряхивайте каждые пять минут в первые 15 минут. На следующий день подготовьте трансфекцию в соответствии с инструкциями выбранного реагента для трансфекции. Для клеток Исикавы используйте 550 нанограммов общей плазмиды для каждой лунки 24-луночного планшета.

Разведите плазмиды до конечной концентрации 020 мкг на миллилитр в бессывороточных средах. Используйте три микролитра реагента для трансфекции на каждый микрограмм ДНК, осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 5-10 минут при комнатной температуре. Добавьте по 25 микролитров готовой смеси в каждую лунку.

Приготовьте достаточный объем буфера для лизиса с 1%-ным бета-меркаптоэтанолом. Отсасывайте среду с помощью вакуумного аспиратора. Промойте клетки один раз равным объемом 1x PBS и аспирируйте, чтобы удалить как можно больше PBS.

Добавьте по 300 микролитров лизисного раствора BME в каждую лунку, используя многоканальную пипетку. Пипеткой проведите раствор лизиса вверх и вниз восемь-десять раз и переложите в глубокую луночную пластину или 1,7-миллилитровые пробирки Эппендорфа на льду. РНК можно извлечь сразу, или заморозить лизаты при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующей переработки.

Показаны конструкции направляющих РНК для трех сайтов связывания транскрипционного фактора вблизи MMP17. Область-мишень является сайтом связывания для ER альфа, как определено ChiP-seq, и четыре направляющие РНК пересекают эту область. Здесь показан ожидаемый продукт направляющей РНК после короткой ПЦР с использованием внутренних праймеров USIC.

В результате реакции к каждому концу фрагмента направляющей РНК из 59 пар оснований будет добавлено по 20 пар оснований, в результате чего получится примерно 100 пар оснований. Показаны качественные результаты ПЦР в эксперименте Enhancer-I на MMP17. Сайты, на которые нацелен Enhancer-I, обозначены черным шестиугольником.

Сайты 1 и 2 необходимы для полного эстрогенного ответа MMP17, в то время как сайт 3 не вносит своего вклада. Сайт 1 может внести некоторый вклад в самовыражение, но наибольшая активность проявляется, когда сайты 1 и 2 активны. После оптимизации для интересующей клеточной линии этот метод может быть выполнен за пять-семь дней, если он выполнен правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проектировать направляющие РНК для Enhancer-I, создавать и трансфицировать сложные пулы направляющих РНК, а также собирать трансфицированные клетки. При попытке проведения этой процедуры важно поддерживать стерильную среду для культивирования тканей и использовать материалы, не содержащие РНКазы и ДНКазы. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как ChiP-seq и RNA-seq, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, где в геноме связывается Enhancer-I и как он влияет на глобальную экспрессию генов.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям к изучению эстроген-индуцированной регуляции генов в эндогенных локусах в геноме человека, вместо использования эпизодических репортеров. Не забывайте, что работа в условиях культивирования тканей млекопитающих может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты.