Характеризующих микрофлора динамика – проточной цитометрии на основе рабочих процессов из чистых культур для природных сообществ

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы микробной экологии и биотехнологии, например, какие экологические концепции управляют той или иной экосистемой. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть использована для замыкания последующей быстрой динамики микробиома с помощью короткого интервального режима отбора проб, оставаясь при этом весьма экономически эффективным. Этот метод может быть использован для получения информации о биотехнологических и природных микробных сообществах, а также о микробиомах животных и человека для улучшения питания и здоровья.

Демонстрировать процедуру будет Флориан Шаттенберг, техник и оператор SediMeter в нашей лаборатории. Чтобы высушить пробу биогазового сообщества, используйте модифицированный наконечник для пипетки объемом один миллилитр, чтобы перенести 200 микролитров вязкого дигестата в двухмиллилитровую пробирку, содержащую 1,7 миллилитра PBS. После тщательного перемешивания поместите пробирки в ультразвуковую ванну на одну минуту, чтобы расформировать все крупные клеточные агрегаты и прикрепить клетки, прилипшие к остаткам растительных клеток.

После ультразвуковой обработки образец тщательно перемешайте и отфильтруйте клетки через сетчатый фильтр с порами 50 микрометров в пластиковую пробирку объемом 2 миллилитров. Разделите фильтрат на четыре аликвоты по 400-й микролитр и центрифугируйте аликвоты два раза, оба раза полностью отбросив надосадочную жидкость, чтобы как можно тщательнее механически обезвожить образец микроба. Затем высушите образец в нагретой вакуумной центрифуге для создания стабильной гранулы и храните гранулу при температуре четыре градуса Цельсия в защищенном от света месте.

Для стабилизации и фиксации образцов активного ила центрифугируют четыре миллилитра клеток и повторно суспендируют гранулу в четырех миллилитрах двухпроцентного формальдегида в PBS. Через 30 минут при комнатной температуре центрифугируйте стабилизированный образец клетки и зафиксируйте гранулу в четырех миллилитрах 70%-ного этанола для хранения при температуре минус 20 градусов Цельсия. Смешайте и перенесите 0,6 миллилитров суспензии фиксированных клеток в стеклянную пробирку, содержащую 1,4 миллилитров PBS, и после тщательного перемешивания обрабатывайте ультразвуком в течение 10 минут, как показано на рисунке.

По окончании ультразвуковой обработки соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах свежей PBS. После тщательного перемешивания произведите ультразвуковую обработку ячеек, как только что продемонстрировано, в течение пяти минут и отрегулируйте внешний диаметр 700 нанометров до 035 с помощью свежего PBS. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре пермеабабляционного буфера, содержащего 0,11 молярной лимонной кислоты, и 4,1 миллимолярного подростка 20, при тщательном перемешивании, в течение 20 минут инкубации при комнатной температуре.

Затем соберите клетки центрифугированием и тщательно повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах окрашивающего раствора, содержащего 0,68 микромолярного DAPI, для инкубации не менее чем за 60 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Для калибровки шариков загрузите смесь шариков для линейной калибровки в проточный цитометр и измеряйте гранулы непрерывно, манипулируя положением сопла и лазерной оптики для предварительной калибровки прибора в линейном диапазоне. Когда пики валиков могут быть вставлены в предварительно установленный калибровочный шаблон, переключитесь в режим регистрации и загрузите логарифмический образец калибровочного валика.

Установите логарифмические пики шариков в соответствии с их предварительно установленным калибровочным шаблоном для точной настройки аппаратного обеспечения прибора и используйте настройку усиления фотоумножителя для внесения необходимых окончательных корректировок положения валика. Таким образом, ежедневная калибровка цитометра и использование гранул в биологических свечах жизненно важны для успеха медленного диализа цитромного микробиома. Когда ячейки будут готовы, перемешайте и отфильтруйте образцы и добавьте в ячейки логарифмическую смесь шариков.

Теперь перемешайте и загрузите образец на цитометр и создайте затвор, чтобы включить окрашенные клетки и исключить шум и гранулы. Затем последовательно анализируйте набор образцов с максимальной скоростью 3000 событий в секунду до тех пор, пока 250 000 клеток не будут обнаружены внутри клеточного затвора. Чтобы проанализировать данные проточной цитометрии, разработайте шаблон главного затвора для использования на всех образцах.

Начните с загрузки стандартных файлов проточной цитометрии в соответствующую программу анализа проточной цитометрии и последовательно обрабатывайте образцы. Загрузите образцы, дважды щелкните по измерению и выберите параметры по осям X и Y в соответствующих выпадающих меню, чтобы открыть график прямого рассеяния и флуоресценции DAPI. Используйте инструмент рисования полигона, чтобы воспроизвести ранее созданный элемент ячейки измерения, чтобы исключить бусины и шум, и назовите строб соответствующим образом.

Перетащите запись элемента ячейки в список всех сэмплов группы и дважды щелкните элемент ячейки, чтобы выборочно отобразить только события ячейки. Определите подсообщества, преобладающие в образце, с помощью инструмента эллиптического вентиля, и объедините их. Затем добавьте дополнительные выделения подсообществ и последующие выборки, пока шаблон главного шлюза не будет соответствовать всем образцам.

Управляйте шаблоном главного ворота с помощью метода сканирования бокового рассеяния для разрешения кластеризации подсообществ близко друг к другу. Затем добавьте все подсообщества в редактор таблиц и установите выходную статистику на частоту родителя. Используйте редактор таблиц для экспорта относительного количества подсообществ в соответствующее программное обеспечение для работы с электронными таблицами и адаптируйте форматирование данных в соответствии с рекомендациями в руководстве на боковой панели.

Затем, чтобы визуализировать динамику и корреляцию подсообщества, установите и загрузите пакет R, а также загрузите и нормализуйте файл txt. Графики прямого рассеяния и флуоресценции DAPI показывают состояния клеточного цикла чистых культур штаммов в разных точках культуры партии. Использование шаблона главного затвора позволяет количественно оценить долю клеток с одной, двумя или несколькими хромосомами, раскрывая, например, способность этого репрезентативного микроба реплицировать свои хромосомы быстрее, чем время его генерации.

При исследовании сложных микробных сообществ с течением времени скорость и значение сдвига сообщества можно легко визуализировать с помощью последовательности точечных диаграмм. Доминирующие субсообщества на разных этапах эксперимента могут быть четко идентифицированы с помощью инструмента цитометрического штрих-кода. Объединение этих данных с частотным распределением относительной численности субсообществ позволяет выбрать ворота, демонстрирующие значительные изменения численности в ключевые моменты времени.

Визуализация этих данных в виде неметрического многомерного графика масштабирования может способствовать более глубокому пониманию динамики сообщества. Биогазовые сообщества потенциально могут сталкиваться с пространственной неоднородностью из-за ограничений по перемешиванию. Образцовые точки отбора проб биогазового сообщества демонстрируют незначительную пространственную, но выраженную временную неоднородность.

Сильная положительная или отрицательная корреляция с абиотическими параметрами, такими как уплотнители продукта, может помочь в понимании и оптимизации экосистем и биотехнологических процессов. Кроме того, они облегчают идентификацию стробов, представляющих особый интерес, для последующей сортировки и анализа. При установлении этой процедуры рекомендуется оценить различные процедуры фиксации и окрашивания, чтобы оценить их эффективность и стабильность для каждого нового набора образцов.

После сортировки могут быть применены дальнейшие подходы, такие как ампликоническое фехтование, метагеномика и протеомика, для выбора основных сообществ, которые предоставляют информацию о протогенетической принадлежности, о состояниях активности метаболических путей. Этот метод проложил путь микробным экологам и инженерам-биотехнологам к отслеживанию динамики микробиома, естественных и контролируемых экосистем с разумными вложениями ресурсов.