8,829 Views
•
06:55 min
•
November 07, 2018
DOI:
Этот метод обеспечивает высокую пропускную способность платформы для скрининга сальмонеллы и шигеллы. Основным преимуществом этой техники является повтор, специфичная, чувствительная и высокая пропускная способность. Этот метод сочетает в себе быстрый метод NAAT и культуру, в которой в режиме реального времени скрининг ПЦР был применен первый, а затем положительные были отправлены для культуры бактерий и идентификации.
Хотя этот метод фокусируется на скрининге сальмонеллы и шигеллы, он также может быть применен к другим патогенным микроорганизмам, таким как Vibrios, Staphylococcus, E.Coli и так далее. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как выбор правильной колонии затруднен из-за фоновой флоры в образцах. Для начала добавьте в каждый образец по три миллилитров питательного бульона.
Затем инкубировать образцы при 36 градусах по Цельсию в течение шести часов. После этого центрифугировать культуру предварительного обогащения на 800 г в течение двух минут. Затем перенесите супернатант в новую трубку и снова центрифуга в течение пяти минут при 12 000 г.
Отбросив супернатант, добавьте в гранулы 100 микролитров раствора для извлечения ДНК. Затем, вихрь трубки в течение одной минуты. Затем нагрейте образец при температуре 1000 градусов по Цельсию в сухой ванне.
Повторив центрифугу, соберите супернатант в новую трубку. Во-первых, создать реакционной смеси и установить велосипедную программу в соответствии с текстовым протоколом. Затем выполните ПЦР в режиме реального времени на флуоресцентной машине ПЦР в режиме реального времени.
Во-первых, добавьте 100 микролитров культуры предварительного обогащения к пяти миллилитров селенитной кристаллической среды. Затем инкубировать культуру при 36 градусах по Цельсию в течение 18-24 часов. Затем соберите одну петлю культуры и выложить ее на тарелку.
Затем инкубировать пластину при 36 градусах по Цельсию в течение 18 до 24 часов. После инкубации выберите подозрительные колонии и перенесите их на тарелку. Инкубировать пластину при 36 градусах по Цельсию в течение 18 до 24 часов.
Затем определите подозрительную колонию с помощью автоматизированной системы идентификации микробов. Чтобы начать характеристику O-антигена, добавьте одну каплю поливалентной сыворотки O-антигена в чистую горку. Перенесите одну петлю колонии на горку и измельчите ее в сере.
Если бактерии выглядят как струящийся песок, повторите предыдущую обработку моновалентной сывороткой O-антигена до тех пор, пока антиген не будет охарактеризован. Чтобы начать характеристику H-антигена, добавьте одну каплю поливалентной сыворотки H-антигена в чистую горку. Затем соберите один цикл колонии и сетки его в сере.
Используйте моновалентную серу H-антигена для повторного лечения до тех пор, пока не будет охарактеризован специфический H-антиген. Чтобы отделить культуру, соберите одну петлю культуры предварительного обогащения и распределив ее на тарелку. Затем, инкубировать место при 36 градусов по Цельсию в течение 18 до 24 часов.
После инкубации соберите подозрительную колонию на тарелку. Инкубировать пластину при 36 градусах по Цельсию в течение 17 до 24 часов. Затем подверги колонию биохимической идентификации с помощью автоматизированной системы идентификации микробов.
Затем нанесите одну каплю поливалентной сыворотки вида Шигелла на чистую горку. Затем используйте микро-петлю, чтобы собрать некоторые бактерии и измельчить его в серу. Наконец, если сера напоминает струящийся песок, используйте моновалентную серу видов Шигелла для дальнейшей характеристики бактерий.
Используя этот протокол, образцы стула у пациентов были проверены на сальмонеллы и шигеллы видов. Используя ПЦР в режиме реального времени, было успешное усиление в канале HEX, что указывает на то, что образец был положительным для видов сальмонеллы. Далее в режиме реального времени ПЦР указал, что образец два был положительным для сальмонеллы и был выбран для управляемых культуры видов сальмонеллы.
В управляемой культуре видов сальмонеллы розовые и фиолетовые колонии покрывались отдельно и подвергались биохимической идентификации. Результаты показали, что колонии из выборки два были Salmonella paratyphi B.Using в режиме реального времени ПЦР, было успешное усиление в канале FAM, что свидетельствует о том, что образец был положительным для видов Шигелла. Далее пЦР в режиме реального времени указал, что образец 10 является положительным для Шигеллы и был выбран для управляемой культуры.
В управляемой культуре видов Шигелла розово-красные и бесцветные колонии покрывались отдельно и подвергались биохимической идентификации. Результаты показали, что в образце 10 содержались бактерии Shigella sonnei фазы II. При попытке этой процедуры важно помнить об ограничении метода из-за изменения последовательности.
Следуя этой процедуре, другие методы, такие как прямая культура, могут быть выполнены, чтобы избежать ложных отрицательных результатов ПЦР в режиме реального времени. Этот метод прокладывает путь для исследователей в области обнаружения сальмонеллы и шигеллы, так как новый протокол может увеличить положительную скорость в два раза и значительно снизить рабочую нагрузку и ТАТ. Не забывайте, что работа с сальмонеллой и шигеллой может быть чрезвычайно опасной, и средства индивидуальной защиты, PPE, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
Salmonella spp.Shigella spp. являются общие патогенов, приписываемых понос. Здесь мы описываем платформу высокой пропускной способностью для проверки Salmonella spp. /Shigella spp., с помощью ПЦР в реальном времени в сочетании с гидом культуры.
15:28
Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием
Видео по теме
7658 Views
11:34
Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов
Видео по теме
13666 Views
12:55
Масштабируемость Высокая пропускная Выбор фага-дисплее синтетических библиотек антител
Видео по теме
18451 Views
11:10
Высокая пропускная Анализ фенотипу
Видео по теме
12559 Views
11:31
Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в
Видео по теме
8334 Views
15:29
Микроскопия основе Анализы для высокопроизводительного скрининга на хост факторов, участвующих в
Видео по теме
8177 Views
08:43
Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул
Видео по теме
10248 Views
11:34
Создание высокопроизводительного скрининга платформы для оценки гетерогенности амплификации гена HER2 в опухоли молочной железы
Видео по теме
12371 Views
10:07
Высок объём измерение плазматической мембраны запечатывания эффективность в клетках млекопитающих
Видео по теме
7656 Views
07:25
Высокопроизводительный скрининг химических соединений для выяснения их влияния на бактериальную персистенцию
Видео по теме
3927 Views
Read Article
Цитировать это СТАТЬЯ
Yang, Z., Chen, X., Tu, C., Su, Y., Wang, H. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).
Copy